内容提要
我们开发了肿瘤酸性和光热控制的纳米系统（NTTD），该系统共负载了新型声敏剂 Na₃TiF₆纳米颗粒（NPs）和近红外二区（NIR-II）发光聚集诱导发光分子（AIEgen，T1），以实现对深部肿瘤的高效声动力疗法 / 光热疗法（SDT/PTT）。NTTD 包含超小的 Na₃TiF₆ NPs，其具有更多的氧空位、窄带隙（2.82 eV）以及对 H₂O 和 O₂分子的良好吸收能力，从而确保在超声（US）刺激下能高效产生活性氧（ROS）。另一方面，借助酸性 / 光热响应以及可深度穿透的 NIR-II 荧光成像（深度可达 7 毫米），NTTD 可在原位进行 “两步” 尺寸转变，以实现声敏剂在肿瘤区域的保留和渗透能力的增强，并且具有高度的时空可控性。在 4T1 肿瘤模型中，与参与被动靶向的 NTT 组相比，NTTD 将肿瘤滞留时间延长至 60 小时，并使成像信号增强了约 2.4 倍。对 NTTD 进一步进行光照射，可辅助其渗透能力提升约 4.5 倍。SDT/PTT 的协同作用在体内引发了显著的 ROS 生成，肿瘤抑制率达到 75.2%。
Na₃TiF₆纳米颗粒的合成与表征
声敏剂 Na₃TiF₆纳米颗粒（NPs）通过一种稳健的有机相策略合成。如透射电子显微镜（TEM）图像所示，Na₃TiF₆ NPs 具有单分散的球形形貌，粒径为 4.38±0.83 nm。高分辨率透射电子显微镜（HRTEM）图像中，晶格间距为 0.199 nm，对应于 Na₃TiF₆晶体的（004）晶面。选区电子衍射（SAED）中（011）、（004）和（-103）晶面的晶格宽度以及制备样品的 X 射线衍射（XRD）图谱均与 Na₃TiF₆标准卡片（JCPDS 卡编号：26-1491）一致，证明了纯晶态 Na₃TiF₆的形成。Na₃TiF₆ NPs 的电子自旋共振（ESR）光谱在 g=2.003 处证实了氧空位的存在，并以商用声敏剂 TiO₂作为对照。充足的氧空位有利于在超声照射下将自由电子（e⁻）捐赠至导带（CB）并转化为 O_V²⁺，从而促进 ROS 的生成。
Na₃TiF₆纳米颗粒的声动力性能
为了探究 Na₃TiF₆ NPs 在声动力治疗（SDT）中的应用潜力，通过 Kubelka–Munk 公式的 Tauc 图计算得出其带隙（Eg）为 2.82 eV。该值比先前报道的无机声敏剂更窄，例如商用 TiO₂（3.20 eV）、ZnO（3.40 eV）、Bi₂MoO₆（3.00 eV）、ZnSnO₃:Nd（2.90 eV）和 TiO₂₋ₓFₓ（2.91 eV），这有助于电子 - 空穴对（e⁻-h⁺）的分离，有利于声化学反应的进行。通过紫外光电子能谱（UPS）确定 Na₃TiF₆的价带（VB）位置：其功函数（Ws）为 3.69 eV，由光子能量（21.22 eV）与二次截止能量（17.53 eV）的差值得到；通过低能区线性近似法获得费米能级相对于价带顶的位置（2.80 eV），进而得出 Na₃TiF₆的 VB 相对于真空能级（vs AVE）为−6.49 eV，转换为相对于标准氢电极（NHE）为 2.05 eV。根据 Eg 值计算得到导带（CB）电位为−0.77 eV。同理，通过 UPS 光谱确定 TiO₂的 VB 和 CB 状态分别为 2.78 eV 和−0.42 eV。因此，Na₃TiF₆和 TiO₂的带边位置如图所示。对比 O₂/・O₂⁻（0.33 V）和 O₂⁻/¹O₂（0.98 V）的氧化还原电位，Na₃TiF₆和 TiO₂更负的 CB 边缘表明其在超声刺激下具有生成 ¹O₂的能力，且 Na₃TiF₆的 CB 边缘比 TiO₂更负，说明其电子接受和催化效率更强。Na₃TiF₆ NPs 的 VB 边缘比 OH⁻/・OH（1.99 V）更正，表明其在超声照射下具有生成・OH 的特性。
以 1,3 - 二苯基异苯并呋喃（DPBF）降解作为 ROS 指示剂检测 ROS 生成。在 Na₃TiF₆ NPs 与 DPBF 的混合体系中，随着超声激活时间（1 MHz，1.0 W/cm²，50% 占空比）的延长，420 nm 处的吸光度呈现典型的漂白现象。与 TiO₂、[Ru (bpy)₃]²⁺、玫瑰红和水相比，Na₃TiF₆ NPs 表现出更高的氧化速率，这与以 2,2,6,6 - 四甲基哌啶（TEMP）作为 ¹O₂捕获剂的 ESR 光谱中检测到的特征性 1:1:1 三重态 ¹O₂信号一致。此外，以 3,3′,5,5′- 四甲基联苯胺（TMB）为指示剂验证了超声照射下・OH 的生成：在超声照射下，混合体系中 650 nm 处出现特征吸收峰，且 Na₃TiF₆ NPs 的・OH 生成信号强于 TiO₂、[Ru (bpy)₃]²⁺、玫瑰红和水，这通过 TMB 的时间依赖性氧化和典型的 1:2:2:1 ESR 信号得以证实。通过单线态氧传感器绿（SOSG）检测到的高效 ROS 生成可在厚度达 10 cm 的猪肉组织中被激活。
尺寸可变 NTTD 的制备与表征
基于 Na₃TiF₆ NPs 优异的超声触发 ROS 生成能力，我们进一步将声敏剂引入双响应脂质体 NTTD 中。通过酰胺键将 DA 连接到 DSPE-PEG₅₀₀₀-NH₂上，获得 pH 响应性脂质。进一步通过薄膜分散法合成脂质体 NTTD。透射电子显微镜（TEM）图像显示，NTTD 分散性良好，直径为 147 nm。NTTD 的高分辨率透射电子显微镜（HRTEM）图像和 X 射线衍射（XRD）图谱中可见 Na₃TiF₆ NPs 的特征（004）晶格间距和典型峰，表明疏水性 Na₃TiF₆ NPs 存在于 NTTD 中。NTTD 中 T1 的负载情况还通过紫外 - 可见吸收光谱证实，其在 692 nm 处有以该波长为中心的宽吸收带，负载率为 15.2%。与商业染料 IR1061 包被的脂质体（NITD）的荧光光谱相比，分散在 PBS 中的 NTTD 的 NIR-II 荧光在 1000 nm 处有最大值（λex=808 nm），这归因于 T1 的聚集诱导发射（AIE）特性。组织仿体成像研究表明，NTTD 的光学穿透深度可达 7 mm，比对照染料 IR820 和含 IR1061 的脂质体更深，也比先前报道的 LZ-1105、Bi-Ag₂S 纳米晶体、Ru1085 和 PN-C18 更深。
与声敏剂 Na₃TiF₆类似，我们测试了 NTTD 在超声照射下的 ROS 生成能力。观察到 DPBF 的吸光度峰降低约 3.3 倍，TMB 在 650 nm 处的吸光度增强约 17.6 倍。此外，NTTD 在 PBS 缓冲液中的流体力学尺寸为 253±21 nm。当 NTTD 在 4℃下储存时，在含 10% FBS 的细胞培养液中 21 天内其流体力学直径无明显变化，表明 NTTD 具有长期稳定性。
受 NTTD 强近红外吸收的启发，我们研究了光热诱导的解体行为。首先测试了 NTTD 在近红外激光（λex=808 nm）下的光热性能。NTTD 溶液（117.0 μg/mL，含 15 μM T1）的温度随时间升高，照射 5 分钟后达到稳定值（53℃），温度升高与浓度和激光功率相关。当接受 “开 - 关” 照射循环时，NTTD 即使在五个循环后仍表现出良好的光热稳定性。经评估，其光热转换效率为 30.68%，高于 IR1061，这确保了热响应脂质体结构的破裂。随着照射时间延长至 10 分钟，流体力学尺寸逐渐减小至 21 nm，TEM 图像显示脂质体结构被破坏。NTTD 在光照射下的时间依赖性 DLS 和 TEM 图像显示，这些热响应脂质体逐渐 “融化”。采用商用氨基甲基香豆素乙酸盐（AMCA）作为模型染料负载到 NTTD 中，以监测其释放能力。照射下 AMCA 的累积释放量达 80.3%，是未照射组的 3.0 倍。这些数据直观地证明了 NTTD 在溶液中的多阶段响应，导致其形态和粒径发生变化。
NTTD 的体外细胞摄取与抗肿瘤性能
在评估 NTTD 的体外治疗性能之前，我们首先研究了其细胞摄取能力和生物相容性。以 L929 小鼠成纤维细胞为模型，在 100 μg/mL 浓度下孵育 24 小时后，细胞存活率高达 87.1%，表明 NTTD 无明显细胞毒性。近红外二区（NIR-II）荧光显微镜成像显示，4T1 细胞内的荧光信号随时间逐渐增强，孵育 8 小时后达到最大值。与 4T1 细胞相比，NTTD 处理的 L929 细胞在孵育 24 小时后荧光信号较弱，这是由于癌细胞活跃的代谢活动加速了细胞膜的通透性，从而增强了 NTTD 的摄取能力。进一步的细胞器共染色实验表明，孵育 4 小时后，NTTD 主要进入并定位于溶酶体（共定位率 0.77），而非线粒体（共定位率 0.60）。
细胞培养环境的酸性会影响 NTTD 的细胞摄取。以含 AMCA 的 NTTD 为模型，当细胞培养液的 pH 值调至 6.5 时，细胞内仅检测到微弱的荧光信号，这是由于 NTTD 在酸性环境中发生聚集，从而抑制了细胞摄取。相反，在 808 nm 激光照射（1.5 W/cm²，5 分钟）后，细胞内观察到强烈的荧光，这归因于光热响应导致脂质体解体并释放 AMCA。
采用 MTT 法评估 NTTD 对 4T1 细胞的体外治疗效率。低功率超声或激光照射不会引起明显的细胞脱落。我们评估了 NTTD 或商用 TiO₂在激光或超声照射后的细胞存活率。与 TiO₂、[Ru (bpy)₃]²⁺和玫瑰红加超声处理组相比，NTTD 加超声（NTTD + US）处理组的细胞存活率显著降低。这些商用声敏剂的半抑制浓度（IC₅₀）超过 100 μg/mL，表明 NTTD 的声敏化能力优于商用声敏剂。NTTD 加激光和超声（NTTD + L + US）处理组的细胞毒性更强，其 IC₅₀值（33.2 μg/mL）低于单独超声（NTTD + US，75.6 μg/mL）或激光照射（NTTD + L，93.8 μg/mL）组。值得注意的是，当细胞培养液的 pH 值降低至 6.5 时，即使 NTTD 浓度达到 100 μg/mL，NTTD + US 处理组的细胞存活率仍为 80.8%，这是由于酸响应聚集影响了 NTTD 的细胞摄取，从而降低了细胞毒性。
肿瘤富集与近红外二区荧光成像
为研究 NTTD 的体内富集情况，将修饰或未修饰 DA 的脂质体（NTTD 和 NTT，9 mg/kg）静脉注射到皮下接种 4T1 乳腺癌肿瘤的小鼠模型中。通过近红外二区（NIR-II）成像系统监测脂质体的分布，并随时间收集信号。值得注意的是，当小鼠接受激光照射（λex=808 nm，0.05 W/cm²，5 分钟）时，荷瘤小鼠的肿瘤温度达到 31℃，该温度低于热敏脂质体的解离温度（约 43℃），证明成像过程中 NTTD 未发生解离。借助 NIR-II 荧光成像，获得了清晰的肿瘤血管图像，具有良好的信噪比（SNR=6.95）和空间分辨率（约 494 μm）。两组的肿瘤荧光均逐渐增强并达到最大值，其中 NTTD 组的最大肿瘤荧光信号是 NTT 组的 2.4 倍，且 NTTD 的滞留时间延长至 60 小时，这有利于形成稳定的成像窗口。此外，NTTD 组的肿瘤 - 肝脏荧光比（tumor/liver）为 0.93±0.034，较 NTT 组（0.44±0.032）提升了 2.1 倍。，NTTD 通过肿瘤酸性触发聚集策略而非被动靶向，实现了更强的肿瘤富集能力。
NTTD 的体内抗肿瘤效果
鉴于 NTTD 在肿瘤富集和渗透方面的理想调控能力，我们进一步探索其在体内的癌症治疗效果。将肿瘤体积约 100 mm³ 的 4T1 荷瘤小鼠随机分组，分别接受以下处理：（1）对照组，（2）单纯激光照射，（3）单纯超声照射，（4）TiO₂+ 超声，（5）NTTD + 激光，（6）NTTD + 超声，（7）NTTD + 激光 + 超声。其中，TiO₂+ 超声组作为对照，用于比较商用声敏剂 TiO₂的声动力治疗效果。在第 5、6 组中，于静脉注射试剂 60 小时后对肿瘤区域进行激光或超声照射；第 7 组则在激光照射 24 小时后进行超声刺激。值得注意的是，超声换能器放置在小鼠腹部，距离肿瘤部位约 2 厘米。每两天监测一次肿瘤进展。22 天后，第 1-3 组未观察到明显的肿瘤生长抑制，肿瘤体积增加至约 1678 mm³，这表明短暂暴露于超声或激光不会对肿瘤造成明显损伤。相比之下，第 7 组的肿瘤体积较其他对照组（4-6 组）受到显著抑制，证明 NTTD 联合激光和超声照射具有优异的治疗效果。这不仅归因于激光调控增强的肿瘤富集和渗透，还得益于光热治疗（PTT）和声动力治疗（SDT）的协同作用。各组的肿瘤生长曲线和小鼠照片直观地显示了 NTTD 在超声联合激光照射下显著的肿瘤杀伤效果。治疗 22 天后，收集残留肿瘤组织称重。第 7 组的肿瘤重量比第 4-6 组低 2.4-3.5 倍，22 天治疗后肿瘤抑制率达 75.2%，而商用声敏剂 TiO₂仅抑制肿瘤生长 12%。此外，各组小鼠的体重无明显变化，主要器官未出现明显损伤和炎症。血常规检测和溶血试验表明，这些治疗未对血液和基本器官功能造成异常，证实了给药脂质体对小鼠的全身毒性较低。
结论
我们通过溶剂热法合成了超小声敏剂 Na₃TiF₆纳米颗粒（NPs）。由于其窄带隙（2.82 eV）、氧空位的形成以及对 O₂和 H₂O 分子的强吸收能力，Na₃TiF₆ NPs 能够富集电子陷阱，促进电子（e⁻）- 空穴（h⁺）对的分离，从而在超声刺激下增强活性氧（ROS）的产生。更重要的是，基于 Na₃TiF₆ NPs 构建的原位尺寸转变纳米系统（NTTD）可显著增强肿瘤内的富集和渗透能力。借助快速酸响应聚集特性，与被动靶向策略相比，NTTD 在肿瘤部位的富集量提升了 2.4 倍。此外，在时空分辨的近红外二区（NIR-II）荧光成像引导下，激光照射调控 NTTD 解离并释放超小 Na₃TiF₆ NPs 和 T1 至深部肿瘤组织，使组织中的钛含量较未照射的 NTTD 组增加 4.5 倍。随后，Na₃TiF₆ NPs 和 T1 引发大量 ROS 生成，在 4T1 肿瘤模型中实现了 75.2% 的肿瘤抑制率，展现出高效的声动力治疗（SDT）与光热治疗（PTT）协同效果。
参考文献
NIR-II imaging guided on-site size variable clustered nanosystem to potentiate sonodynamic therapy in deep-seated tumors,Qi Yu ,* Yujing Zhou , Qin Zhang , Juan Li , Shan Yan , Jie Xu , Cao Li ,Xiaobo Zhou **, Yao Sun ,Biomaterials 322 (2025) 123381,https://doi.org/10.1016/j.biomaterials.2025.123381
