内容提要
本文开发了一种白蛋白特异的、共价标记的近红外II(NIR-II)染料，具有对内源性白蛋白的高选择性，用于靶向成像EB干扰。我们的白蛋白标记染料作为发色团原位构建NIR-II荧光蛋白，大大提高了亮度。因此，通过原位标记内源性白蛋白作为有效的“靶向剂”，我们可以精确地成像各种内皮屏障的破坏。与具有酶降解或免疫系统捕获问题的传统外源性靶向试剂(例如，染料标记的抗体)不同，原位白蛋白标记在靶向成像方面表现出超高的性能。
基于非甲基染料NIR-940的原位荧光蛋白的构建
由于白蛋白可以作为破坏EB的生物标志物，我们的目标是开发一种理想的近红外染料，用于白蛋白特异性的原位靶向，不受环境或其他蛋白质的干扰。具有合适结构的染料能够与白蛋白共价结合形成原位近红外荧光蛋白(FP)，从而作为一种可靠的原位靶向造影剂进行靶向成像。我们已经证实，所有的NIR-I/II染料也可以用于NIR-II成像(对于NIR-I染料，其尾部发射用于NIR-II成像)。因此，我们从所有市售和我们自制的含氯菁染料中选择了两种先前确定的最佳羧基NIR-I/II染料(IR-808和CO-1080)进行比较。我们试图精细地调整菁染料的化学结构，使内源性白蛋白能够进行受控标记，以准确地成像EB干扰。为了实现理想和最佳的白蛋白原位结合，受染料与白蛋白口袋中的硫醇基团之间的亲核取代作用的启发，我们合成了一种具有独特的双Meso-Cl结构的非甲胺染料NIR-940。，我们合理地假设NIR-940的结构具有与白蛋白共价结合并固定在疏水口袋中的能力。通过结合在808 nm激发的IR-808染料，在915 nm激发的NIR-940染料，以及在1064 nm激发的CO-1080染料，我们能够同时比较同一NIR-II窗口下的三种染料与可接受的串扰水平。我们分别测量了IR-808、NIR-940和CO-1080在磷酸盐缓冲盐水(PBS)、二甲基亚砜(DMSO)和20%小鼠血清中的吸收和发射光谱。与理论计算一致，NIR-940的吸收峰波长位于IR-808和CO-1080之间。结果表明，NIR-940在PBS溶液中表现出与IR-808或CO-1080相似的H聚集荧光猝灭行为。在20%的血清中，NIR-940在较长波长的吸收峰与DMSO相比蓝移了15 nm，显示了三种分子中最大的变化。我们假设NIR-940在白蛋白中的扩展多亚甲基桥经历了显著的结构限制效应，导致非辐射弛豫降低，导致波长蓝移。NIR-940在血清中的荧光强度比在DMSO中的荧光强度高86.6%，表明这三个分子中亮度保留率最高。NIR-940在不同有机溶剂中的吸收光谱表明，在极性有机溶剂DMSO中发生了H-聚集行为。考虑到与PBS相比，NIR-940在血清中的强荧光和量子产率增强，我们推测具有双Meso-Cl结构的NIR-940与白蛋白具有较高的亲和力。
在对NIR-940染料进行全面的生物兼容性评估后，IR-808、NIR-940和CO-1080分别经尾静脉给药，并通过NIR-II全身成像监测三种染料在体内的药代动力学。在选定的时间点对肝脏信号和肝脏与皮肤的信号比进行了统计分析，显示了三种染料在药代动力学上的明显差异。首先，三种肝脏信号都随着时间的推移而减弱。尽管IR-808具有最高的肝脏信号，但其肝脏与皮肤的信号比率一直很低，这表明IR-808的皮肤积累很高。相比之下，NIR-940和CO-1080被皮肤/肌肉吸收较少，都显示出肝脏与皮肤的信号比率，最初是上升的，然后下降。最初的增加归因于注射后立即被皮肤吸收的峰值，此时肝脏与皮肤的信号比较低，并随着皮肤吸收的下降而增加，而随后的下降是由于肝脏信号的减少。注射染料48小时后处死小鼠，对各脏器的荧光信号进行定量分析。肝脏信号归一化为100%，NIR-940显示的皮肤信号最低。相反，与其他两种染料相比，IR-808表现出明显更高的皮肤信号。在全身成像过程中的特定时间点从小鼠身上采集血清样本，用PBS稀释，然后进行凝胶电泳法进行定量条带亮度分析。结果证实，在给药1分钟后，血清中没有游离染料荧光带，仅检测到白蛋白荧光带。这表明这三种染料在体内都能与小鼠血清白蛋白快速结合。此外，白蛋白条带的荧光强度随着时间的推移而减弱，这与图1H中描绘的三种染料的肝和胆汁清除情况一致。这些结果为NIR-940与小鼠血清白蛋白的体内有效结合提供了初步证据，用于白蛋白原位标记和仿生FP构建。
三种原位仿生FP(SBFP-808、SBFP-940和SBFP-1080)对血脑屏障破坏靶向成像
这些标记的白蛋白分子随后可以用作示踪剂，跟踪白蛋白在组织中的移动和积累，从而提供对屏障完整性和渗漏的直接可视化。鉴于光性血栓卒中(PTS)模型在破坏BBB和促进白蛋白渗透到受损区域的潜力，我们假设原位仿生FP可以作为破坏BBB的靶向成像工具。虽然IR-808、NIR-940和CO-1080都通过白蛋白结合显示了原位仿生FP(SBFP-808、SBFP-940和SBFP-1080)的能力，但我们在图中的观察显示了它们在代谢谱和器官特异性分布方面的特定差异。此外，图中的数据显示了这些染料与白蛋白结合动力学的变化。因此，我们假设每种染料都会对血脑屏障的破坏表现出不同的靶向效应。创建PTS模型的详细程序在《材料和方法》中介绍。模型建立后，小鼠分别接受IR-808、NIR-940和CO-1080的静脉注射以进行NIR-II靶向成像，以比较它们在特定时间点监测血脑屏障破坏的有效性。随后，在48小时给药期后，对小鼠进行安乐死，对脑组织进行四苯基四氮唑(TTC)染色，以量化受损部位的渗漏面积。
结果表明，给予IR-808、CO-1080和NIR-940后，小鼠的血脑屏障破坏面积分别为6.22、6.94和6.58mm2，这表明具有相同破坏水平的小鼠的脑梗塞面积相似。我们通过将TTC染色的测量区域设置为100%来归一化SBFP-808、SBFP-940和SBFP-1080的荧光成像监测的泄漏区域。结果表明，三种SBFPS荧光成像分别在1h及更早时间点发现的渗漏面积小于TTC染色，在1h时间点三种SBFPS的渗漏面积基本相同。SBFP-808和SBFP-1080从3小时成像时间点开始，在血脑屏障破坏区域均表现出实质性的扩散，峰值达到12小时左右。相反，SBFP-940在3h成像时间点所描绘的渗漏区域与TTC染色显示的渗漏区域基本一致，此后波动较小，表明SBFP-940在损伤部位没有发生扩散，从而能够准确地成像BBB破坏。考虑到损伤部位荧光信号强度的时间衰减，NIR-940检测BBB破坏的成像时间窗为染液后1~24小时，而SBFP-808和SBFP-1080的最佳成像时间点仅为染液后1小时。由于扩散快，衰减严重，SBFP-808和SBFP-1080只有一个较短的成像窗口。在信号背景比(SBR)的比较中，SBFP-940在几乎所有成像时间点都显示出最高的SBR，并在1至24小时成像窗口内保持SBR为4或更高。SBFP-808和SBFP-1080的最佳成像SBR是在注射后3-6小时内观察到的；然而，由于此后的大量扩散，准确显示血脑屏障破坏区域变得不可行。
Fe-2PEG是一种具有高荧光量子产率和光稳定性的D-A-D染料，它可以通过增强渗透性和保留率(EPR)效应在肿瘤中被动积聚，并且在肿瘤成像中具有高信噪比，适合于荧光引导手术切除肿瘤。为了进一步证明NIR-940对血脑屏障破坏具有良好的靶向成像效果，将FE-2PEG组作为对照。结果表明，FE-2PEG可以照亮血脑屏障破裂区，但成像信噪比较低，不能准确定位破裂区。
我们还测试了我们之前发表的研究中使用的一小批菁染料，所有这些染料都用于静脉给药后1、3和6小时的特定时间点的BBB干扰的NIR-II靶向成像。遗憾的是，没有一种染料同时表现出令人满意的SBR和准确的渗漏区域可视化。这表明进一步全面研究体内菁染料的结构和功能之间的相关性是建立针对血脑屏障破坏的NIR-II靶向成像的必要的。然而，具有双Meso-Cl结构的NIR-940是成像EB破坏的理想试剂之一。
使用相同剂量的孟加拉玫瑰和更短的造模时间5分钟，可以进一步减轻小鼠PTS模型的严重程度。详细的建模过程可以在《材料和方法》中找到。对SBFP-808、SBFP-940和SBFP-1080监测较轻血脑屏障损伤的NIR-II靶向成像能力进行了比较分析。结果表明，在给药后不同时间点，SBFP-940具有最高的SBR和较小的渗漏面积，而SBFP-808和SBFP-1080在给药后3h及以后表现出严重的扩散。这些结果表明，NIR-940更适合于长期监测和靶向成像，以评估不同程度的血脑屏障破坏。
值得注意的是，先前的一项研究主要集中在缺血性中风发生后6小时。然而，这项工作的成像结果表明，中风发生一小时后，白蛋白在受损区域明显泄漏。这一现象得到了进一步的验证。模型小鼠静脉注射NIR-940后1h处死。用放射免疫沉淀分析缓冲液分别提取卒中区和对侧正常脑区的脑组织。作为另外两个对照，小鼠后肢的皮肤和肌肉组织也分别被提取和裂解。在离心和定量蛋白质浓度后，对裂解产物进行凝胶电泳。结果表明，NIR-940修饰的内源性白蛋白条带在卒中组有明显的荧光强度，而在其他对照组，包括对侧正常脑组织中未检测到荧光条带。考马斯蓝染色结果进一步表明，与对侧正常脑组织相比，卒中组发生了明显的白蛋白渗漏。用于卒中区域实时可视化的SBFP-940有助于我们进一步了解卒中早期血脑屏障中断的过程。
缺血性中风是一个复杂的、动态的、多阶段的疾病过程。在缺血性卒中早期(6小时)，血脑屏障功能障碍和随后的血脑屏障漏导致血管源性水肿的发生。这种渗漏过程很可能是通过跨细胞作用发生的，而TJs的破坏发生在较晚的阶段(2天后)。尽管有许多不同的卒中模型被广泛使用，但这项工作中使用的PTS模型也在先前报道的研究中得到了验证。缺血性卒中后血脑屏障严重受损。下文中定义的“轻微干扰”并不代表“最小干扰”。此外，由于白蛋白的大小，在生理条件下(例如衰老)的血脑屏障通透性的变化和在其他疾病模型中轻微的血脑屏障破坏很可能无法检测到。为了检测不同程度的血脑屏障破坏，可能需要结合不同分子大小的示踪剂。
结论
我们成功地开发出了一种以前从未探索过的NIR-II染料，它具有最佳的白蛋白结合亲和力，能够在体内精确显示EB破坏。这项工作代表着生物成像领域向前迈出的显著一步，与传统成像技术相比，它提供了一种更安全、更准确、侵入性更小的靶向手段。通过实现对屏障破坏的实时、高分辨率成像，我们的方法为促进我们对疾病过程的理解和评估治疗干预的效果提供了强大的工具。
参考文献
In situ albumin tagging for targeted imaging of endothelial barrier disruption.Zetao Dang,Xue Zheng,Yanli Gao,Yijing Du,Yuewei Zhang,and Shoujun Zhu.Sci.Adv.11,2025,11,eads, 4412. https://doi.org/10.1126/sciadv.ads4412
