内容提要
本文设计并合成了一种以 6,7 - 二（呋喃 - 2 - 基）-[1,2,5] 噻二唑并 [3,4-g] 喹喔啉（DFTQ）为受体、二噻吩并 [3,2-b:2',3'-d] 吡咯（DTP）为供体的 D-A-D 型 NIR-II 荧光团，并且通过分别引入四苯乙烯（TPE）和三苯胺（TPA）的聚集诱导发光（AIE）单元实现了 AIE 功能，总共形成了三种 NIR-II 荧光团 DFTQ-DTP、DFTQ-DTPE 和 DFTQ-DTPA。这些荧光团被两亲性的 DSPE-PEG2000 包裹，形成水分散性纳米颗粒（NPs）。以 DFTQ-DTPA 纳米颗粒作为造影剂和光热治疗（PTT）剂，在大于 1300nm 的窗口中实现了高分辨率的体内荧光成像，并且还展示了其在光声成像中的良好性能以及在荷瘤小鼠中的高效肿瘤PTT疗效。
含 DFTQ 荧光团的合成与表征
我们提出使用呋喃修饰噻二唑并喹喔啉，形成一种新的电子受体 DFTQ。在与强供体 DTP 形成 D-A-D 型荧光团后，我们通过量子化学计算将 DFTQ 与其他一些基于噻二唑并喹喔啉的受体进行了比较。为了提高其在聚集态下的发射性能，我们在 DFTQ-DTP 的两侧进一步引入 TPE 和 TPA，分别得到两种 AIE 荧光团 DFTQ-DTPE 和 DFTQ-DTPA。DFTQ 受体是通过 1,2 - 二（呋喃 - 2 - 基）乙烷 - 1,2 - 二酮与 4,7 - 二溴苯并 [c][1,2,5] 噻二唑 - 5,6 - 二胺反应合成的。
在甲苯中测量了 DFTQ-DTP、DFTQ-DTPE 和 DFTQ-DTPA 的吸收光谱和发射光谱。DFTQ-DTP、DFTQ-DTPE 和 DFTQ-DTPA 的最大吸收/发射波长分别位于 893/1072nm、911/1090nm 和 916/1098nm为了进一步研究这三种荧光团在聚集态下的荧光性质，我们测定了它们在不同水体积分数的 THF/ H2O 混合溶液中的发射光谱。随着 的增加，DFTQ-DTP 的荧光强度显著降低，这主要是由于其平面性导致在聚集态下分子间的π-π) 堆积，揭示了 DFTQ-DTP 典型的聚集导致猝灭（ACQ）特征。相反，DFTQ-DTPE 和 DFTQ-DTPA 在fw从 0% 增加到 90% 的过程中表现出显著的荧光增强。当fw达到 90% 时，DFTQ-DTPE 和 DFTQ-DTPA 的荧光强度分别是纯 THF 中的 4.48 倍和 4.77 倍，这证明了 AIE 过程的发生。此外，通过近红外二区荧光成像系统也观察到了DFTQ-DTPE和DFTQ-DTPA的 AIE 特性。引入 TPE 或 TPA 基团不仅可以扩大共轭体系、减小带隙，还可以抑制分子间的(π-π) 堆积，使 DFTQ-DTPE 和 DFTQ-DTPA 具有红移的吸收和发射以及 AIE 特性。
负载荧光团纳米颗粒的制备与表征
我们采用纳米沉淀法，用两亲性聚合物 DSPE-PEG2000 包裹它们，形成水分散性纳米颗粒（NPs），即 DFTQ-DTP NPs、DFTQ-DTPE NPs 和 DFTQ-DTPA NPs。通过使用预先建立的校准曲线进行吸光度分析，测得 DFTQ-DTP NPs、DFTQ-DTPE NPs 和 DFTQ-DTPA NPs 的荧光团负载量分别为 4.5 wt%、4.5 wt% 和 4.4 wt%，包封率分别为 95%、95% 和 93%。采用透射电子显微镜（TEM）和动态光散射（DLS）测量来分析它们的形态结构和粒径。每种纳米颗粒都呈现出典型的球形。DFTQ-DTP NPs、DFTQ-DTPE NPs 和 DFTQ-DTPA NPs 的平均直径分别约为 61.3 nm、60.7 nm 和 63.4 nm，通过 DLS 测定它们的平均流体动力学直径分别约为 86.9 nm、82.9 nm 和 89.8 nm。为了评估这些纳米颗粒在近红外二区（NIR-II）窗口的生物成像能力，我们研究了它们在水介质中的光学性质。DFTQ-DTP NPs、DFTQ-DTPE NPs 和 DFTQ-DTPA NPs 在水中的最大吸收/发射波长分别位于 899/1098 nm、918/1106 nm 和 922/1127 nm，与它们在甲苯中的分子对应物相比发生了红移。
光热性能
荧光团的激发态能量不仅可以通过辐射弛豫途径以光的形式释放，还可以通过非辐射弛豫途径转化为热。我们进一步研究了三种纳米颗粒在 808nm 激光照射下的光热行为。在 808nm 激光照射下，所有纳米颗粒的温度升高都呈现出浓度和激光功率依赖性。在功率密度为 0.8W/cm² 的激光照射 6 分钟后，DFTQ-DTP 纳米颗粒、DFTQ-DTPE 纳米颗粒和 DFTQ-DTPA 纳米颗粒（在水中浓度为 200μg/mL）的温度分别达到 71.2℃、68.2℃和 69.6℃，这有利于杀死癌细胞。经过五个交替的照射 / 冷却循环后，三种纳米颗粒的光热性能均未出现明显变化，表明它们具有出色的光热稳定性。此外，我们测量了 DFTQ-DTP 纳米颗粒、DFTQ-DTPE 纳米颗粒和 DFTQ-DTPA 纳米颗粒在水溶液中 808nm 激光照射下的光热转换效率（PCE），分别约为 58.5%、48.8% 和 51.6%。
体外光热治疗
我们选择 DFTQ-DTPA 纳米颗粒进行后续的生物成像和癌症治疗研究。在 808nm 激光（0.8W/cm²）照射 6 分钟后，两种细胞系的存活率均呈浓度依赖性下降，这表明 DFTQ-DTPA 纳米颗粒在 808nm 激光照射下可作为光热治疗剂杀死肿瘤细胞。通过钙黄绿素 - AM 和碘化丙啶（PI）共染色分析也证实了 DFTQ-DTPA 纳米颗粒的光毒性。在 “DFTQ-DTPA 纳米颗粒 + 激光” 组中，4T1 细胞用 DFTQ-DTPA 纳米颗粒（200μg/mL）处理并进行激光照射（808nm，0.8W/cm²，6 分钟），很大比例的细胞被 PI 染成红色，这表明 DFTQ-DTPA 纳米颗粒在激发后具有显著的细胞杀伤能力。相比之下，在 “PBS - 激光”、“PBS + 激光” 和 “DFTQ-DTPA 纳米颗粒 - 激光” 组中，在整个视野中观察到大量绿色荧光信号，这表明单独使用 DFTQ-DTPA 纳米颗粒或激光时几乎没有细胞凋亡。此外，为了研究 DFTQ-DTPA 纳米颗粒的细胞摄取情况，将4T1细胞与不同浓度的 DFTQ-DTPA 纳米颗粒共培养并用 PBS 冲洗后，将其均匀浸没在琼脂糖中，然后在近红外二区荧光成像系统上成像。随着纳米颗粒浓度的增加，琼脂糖中的荧光信号逐渐变亮，这表明 4T1 细胞可以摄取并内化 DFTQ-DTPA 纳米颗粒。
体内血管成像
我们使用了一种荧光模型，该模型由两根充满 DFTQ-DTPA 纳米颗粒（DFTQ-DTPA 浓度为 1mg/mL）的毛细血管组成，并覆盖有不同厚度的鸡胸组织，以此来评估在不同光谱窗口下的成像分辨率和深度。随着鸡胸组织厚度的增加，信噪比（S/N）逐渐降低。尽管如此，即使在组织厚度达到 8mm 时，使用 1300 - 1400nm 带通（BP）发射滤光片，毛细血管的轮廓仍清晰可辨，且在 1300 - 1400nm 窗口的成像分辨率和深度明显优于 1000 - 1100nm 窗口。在使用不同长通（LP）滤光片（1000、1100、1200 和 1300nm）进行的体内成像中，我们也观察到了类似的现象。将 PBS 中的 DFTQ-DTPA 纳米颗粒（200μL，DFTQ-DTPA 浓度为 1mg/mL）通过静脉注射到健康的雌性 BALB/c 小鼠体内后，在 808nm 激光激发下，利用近红外二区荧光成像系统对小鼠进行成像。与使用 1000LP 滤光片拍摄的图像相比，使用 1300LP 滤光片拍摄的图像具有更高的分辨率和更低的背景。使用 1300LP 滤光片时，获得了 2.06 的高信噪比，脑内血管显著增强，更多细节清晰可辨。相比之下，在 1000、1100 和 1200LP 滤光片下，成像分辨率在一定程度上受到影响，信噪比分别为 1.27、1.38 和 1.59。此外，DFTQ-DTPA 纳米颗粒的荧光信号主要位于血管内，由于其在大于 1300nm 光谱范围内具有更高的分辨率和更低的自发荧光，使得这一特征在成像中体现得更为明显。腹部成像也显示出类似的结果，1300LP 滤光片的信噪比为 1.78 和 1.63，而 1000LP 滤光片的信噪比为 1.33 和 1.25。更高的成像分辨率使得成像中观察到的血管直径更接近实际直径，这对于成像引导治疗等临床应用至关重要。
体内光热治疗
以皮下接种 4T1 肿瘤的小鼠为模型动物，评估 DFTQ-DTPA 纳米颗粒的体内光热治疗（PTT）效果。将荷瘤小鼠随机分为四组，分别接受 PBS、DFTQ-DTPA 纳米颗粒、PBS + 激光、DFTQ-DTPA 纳米颗粒 + 激光处理，每组 10 只。DFTQ-DTPA 纳米颗粒组和 DFTQ-DTPA 纳米颗粒 + 激光组通过尾静脉注射 200μL PBS 中的 DFTQ-DTPA 纳米颗粒（DFTQ-DTPA 浓度为 1mg/mL）。PBS 组和 PBS + 激光组给予相同体积的 PBS。根据近红外二区荧光成像（NIR-II FLI）和光声成像（PAI）结果，在注射后 48 小时，DFTQ-DTPA 纳米颗粒在肿瘤中的浓度达到最大值，此时对肿瘤进行 808nm 激光（0.8W/cm²）照射 6 分钟或不照射处理。在激光照射过程中，通过红外热像仪实时监测肿瘤温度。DFTQ-DTPA 纳米颗粒 + 激光组的肿瘤温度在 2 分钟内从 34.4℃迅速升高到 55.5℃，然后在 59℃左右达到平台期。相比之下，PBS + 激光组在激光照射后仅出现轻微的温度升高（ΔT=2.5℃），这表明在没有 DFTQ-DTPA 纳米颗粒的情况下，光热效应可忽略不计。在激光照射 3 小时后，每组取 5 只小鼠进行人道处死。切除肿瘤，进行切片，用于苏木精 - 伊红（H&E）染色、Ki67 检测和末端脱氧核苷酸转移酶（TdT）介导的 dUTP 缺口末端标记（TUNEL）检测，以评估肿瘤细胞的增殖和凋亡情况。可以看出，与其他三组相比，DFTQ-DTPA 纳米颗粒 + 激光组的细胞凋亡 / 坏死水平最高，增殖水平最低，这表明 DFTQ-DTPA 纳米颗粒具有显著的光热治疗效果。
总结
我们发现呋喃修饰的噻二唑并喹喔啉比其他基于噻二唑并喹喔啉的受体具有更强的吸电子能力，因此作为受体使用时，能够赋予供体-受体-供体（D-A-D）型近红外二区（NIR-II）荧光团更长的发射波长。基于这一理论预测，我们设计并合成了一种新型的以 DFTQ 为受体、DTP 为供体的 D-A-D 型 NIR-II 荧光团，并且分别通过引入四苯乙烯（TPE）和三苯胺（TPA）的聚集诱导发光（AIE）单元，进一步获得了 AIE 特性，总共形成了三种 NIR-II 荧光团 DFTQ-DTP、DFTQ-DTPE 和 DFTQ-DTPA。为实现生物应用，疏水性荧光团被 DSPE-PEG2000 包裹，生成水分散性纳米颗粒（NPs）。每种荧光团或纳米颗粒的几乎全部发射光都落在 NIR-II 光谱范围内，部分发射光超过 1300nm。
参考文献
Furan-modified thiadiazolo quinoxaline as an electron acceptor for constructing second near-infrared aggregation-induced emission fluorophores for beyond 1300 nm fluorescence/ photoacoustic imaging and photothermal therapy,Mengke Liang ,Luyu Liu ,Ying Sun ,Jia Li ,Ling’e Zhang ,Xiqun Jiang ,Wei Wu, Aggregate. 2024;5:e458.,https://doi.org/10.1002/agt2.458
