内容提要
共轭聚合物在光热疗法中常被用作光热剂（PTAs），如今已成为 NIR-II 成像的有前景的候选材料。然而，由于其延伸的 π 共轭主链之间存在强烈的 π-π 堆积相互作用，导致聚合物发生聚集，从而降低了成像效率。在本研究中，我们设计了一种新型共轭聚合物（CP），并通过聚乙二醇化（PEGylation）开发了一种集成纳米平台 [CPN-PEG，n = 2 或 5]。与物理包封的纳米颗粒（F127@CPN）相比，CPN-PEG 在近红外吸收方面发生红移，且 NIR-II 荧光强度显著增强（提高了 2.97 倍）。CPN-PEG5k 保持了高达 58.6% 的出色光热转换效率。CPN-PEG5k 在小鼠详细血液循环成像中验证了其卓越的 NIR-II 成像性能，信噪比达到 8.9。另外，在乳腺癌小鼠模型中，CPN-PEG5k 成功根除了肿瘤并激发了免疫反应，有效抑制了肿瘤的进展和转移。
结果与讨论
CP 的合成与光物理性质
首先合成了一种基于卟啉的近红外二区共轭聚合物。合成过程从含有溴噻吩的卟啉单体 。利用 Stille 反应，将 M1 单体与 2,5 - 双 (2 - 乙基己基)-3,6 - 双 (5 - 三甲基锡基) 吡咯并 [3,4-c] 吡咯 - 1,4 - 二酮（M2）和 2,6 - 二溴 - 4,4 - 二十二烷基 - 4H - 环戊并 [2,1-b:3,4-b’] 二噻吩（M3）进行偶联，制备出共轭聚合物（CP）。CP 在 740nm 处有一个突出的吸收峰，在 808nm 处也有明显吸收。当用 808nm 激光激发时，CP 在近红外二区强烈发射，主要发射峰位于 1095nm。接下来，进一步研究了 CP 的荧光发射性能。首先观察到 CP 的荧光发射强度随浓度升高而增加，这表明其具有显著的浓度依赖性。鉴于 CP 的吸收峰较宽，且在 650 - 830nm 范围内吸收峰较为平坦，我们在四种不同激光（660nm、755nm、808nm 和 915nm）照射及不同滤光条件下，对 CP 的荧光强度进行了检测。808nm 激光照射下 CP 的荧光强度明显高于 660nm、755nm 和 915nm 激光照射时的强度。
尽管 CP 在近红外二区成像方面具有潜力，但其较大的平面 π 体系往往会导致高疏水性和聚集诱导猝灭（ACQ）效应。为了提高 CP 的水溶性和生物相容性，采用了两种方法。第一种方法是聚乙二醇化：利用 CP 卟啉部分中五氟苯基与硫醇基团的反应活性，构建了含有不同长度聚乙二醇链（PEG2k 或PEG5k ）的(CP - PEG) ，并自组装形成 CP 纳米颗粒（(CPN - PEG2k) 和(CPN - PEG5k) ）。第二种方法是将 CP 与普朗尼克 F127（PEO - b - PPO - b - PEO）进行物理共组装，制备纳米颗粒（F127@CPN）。使用动态光散射（DLS）和透射电子显微镜（TEM）对这三种纳米组装体的形态和粒径进行了分析。(CPN - PEG2k) 和(CPN - PEG5k) 的平均粒径分别为 77.8nm 和 84.8nm，而 F127@CPN 的粒径为 94.2nm。三种纳米组装体的粒径分布均匀，多分散指数（PDI）均不超过 15%，这表明它们具有良好的分散性。(CPN - PEG2k) 、(CPN - PEG5k) 和 F127@CPN 的 TEM 图像显示出均匀的球形形态，与 DLS 结果相符。此外，(CPN - PEG2k) （-13.1mV）、(CPN - PEG5k) （-16.3mV）和 F127@CPN（-12.2mV）的表面电荷均显示出负的 ζ 电位。
对这三种纳米组装体的吸收光谱和发射光谱进行了研究。F127@CPN 在 652nm 处有一个突出的吸收峰，而(CPN - PEG2k) 和(CPN - PEG5k) 的最大吸收峰分别位于 689nm 和 700nm。与 CP 相比，三种纳米组装体均出现了不同程度的蓝移（F127@CPN 蓝移约 88nm，(CPN - PEG2k) 蓝移约 51nm，(CPN - PEG5k) 蓝移约 40nm）。另一方面，(CPN - PEG2k) 和(CPN - PEG5k) 在 650 - 850nm 之间具有更宽的吸收范围。值得注意的是，与其他两种纳米组装体相比，(CPN - PEG5k) 在 808nm 处表现出更强的吸收。在 808nm 激光照射下，对三种纳米组装体的荧光发射进行了表征。三种纳米组装体均呈现出相似的近红外二区荧光发射光谱，而(CPN - PEG5k) 的荧光发射明显更强，分别比 F127@CPN 和(CPN - PEG2k) 高 2.97 倍和 1.20 倍。这一结果与三种纳米组装体的荧光图像相符。此外，在不同浓度下，(CPN - PEG5k) 的荧光发射均明显强于(CPN - PEG2k) 和 F127@CPN。这归因于 PEG 作为侧链的引入，它减少了 π-π 堆积相互作用，减轻了聚集诱导猝灭（ACQ）效应。因此，(CPN - PEG2k) 和(CPN - PEG5k) 的荧光发射均优于 F127@CPN，其中(CPN - PEG5k) 由于 PEG 链更长，荧光强度最高。此外，PEG 链有助于屏蔽供体 - 受体 - 供体（D - A - D）荧光团 CP 与水分子之间的相互作用，最大限度地减少能量损失，进一步增强荧光发射。总之，(CPN - PEG5k) 在三种纳米组装体中表现出最佳的荧光发射特性，使其在近红外二区荧光成像方面具有优势。
CPN-PEG5k 对小鼠后肢血管进行荧光血管造影
将 200μL 浓度为(2mg/mL) 的(CPN - PEG5k) 的 PBS 溶液静脉注射到裸鼠体内，并立即在近红外二区（808nm 激光，1300nm 长通滤光片，曝光时间 50ms）对后肢进行成像。如使用(CPN - PEG5k) 进行的高分辨率近红外二区血管造影能够清晰地区分股动脉（红色箭头）和静脉（蓝色箭头）。相应的横截面强度分布图显示出尖锐的峰值。我们识别出两条主要股血管的峰值，并用高斯函数进行拟合，测量出股动脉的直径约为 0.179mm，股静脉的直径约为 0.146mm。此外，高分辨率近红外二区血管造影清晰地显示出从股动脉分支出来的 3 条小动脉。横截面强度分布图显示出尖锐的峰值，表明了动脉分支的直径（分别为 0.115mm、0.072mm 和 0.123mm）。这些结果表明，(CPN - PEG5k) 能够实现约 70μm 的高空间分辨率血管成像。
CPN-PEG5k光分热和光动力学性质研究
我们研究了 CPN-PEG5k 在 808nm 激光照射下的光热和光动力性能。，CPN-PEG5k 的温度升高与浓度和功率相关。在浓度为 20μg/mL、功率为 0.5W/cm² 时，CPN-PEG5k 分散液在 5 分钟内迅速升温至约 45.1°C，超过了杀死癌细胞所需的温度（约 42°C）。相比之下，空白样品由于在 808nm 处的吸收率较低，温度升高极小，从而减少了对组织的损伤。接下来，通过加热 - 冷却循环评估 CPN-PEG5k 的光热稳定性。在三个照射循环（1W/cm²，5 分钟）后，光热性能的下降可以忽略不计。进一步评估 CPN-PEG5k 的光热转换效率（PCE），发现其 PCE 值为 58.6%。这些结果表明，CPN-PEG5k 在 808nm 激光照射下具有出色的光热性能。此外，由于 CPN-PEG5k 在 700-800nm 范围内具有广泛而强烈的吸收，还评估了其在 750nm 激光照射下的光热性能。在浓度为 40μg/mL 时，CPN-PEG5k 分散液在 750nm 照射（1W/cm²，10 分钟）下达到的最高温度为 51.3°C，低于 808nm 照射下的 64.4°C。此外，其 PCE 也较低，为 41.6%。值得注意的是，在 808nm 激光照射下，CPN-PEG2k 和 CPN-PEG5k 的光热性能没有显著差异。此外，使用二苯基异苯并呋喃（DPBF）检测 CPN-PEG5k 的光动力性能。在 750nm 和 808nm 激光照射下，DPBF 在 421nm 处的吸收呈现相似的下降趋势，表明在两种条件下产生的 ROS 相当。然而，在 808nm 激光照射下，CPN-PEG5k 比 CPN-PEG2k 表现出更好的 ROS 生成能力。总之，CPN-PEG5k 在 808nm 激光照射下表现出出色的光热和光动力性能，在肿瘤消融方面具有巨大潜力。
鉴于 CPN-PEG5k 优异的光热和光动力性能，它在肿瘤治疗方面显示出巨大的潜力。为了评估其性能。在 750nm 和 808nm 激光照射下，用 CPN-PEG5k 处理的 4T1 细胞活力显著下降。在相同功率和照射时间下，808nm 激光诱导的细胞毒性明显高于 750nm 激光，这是因为 808nm 激光使 CPN-PEG5k 产生更多热量。为了直观评估不同处理下 4T1 细胞的存活情况，用 AM 和 PI 对细胞进行染色（绿色：活细胞；红色：死细胞）。CPN-PEG5k + 808nm 激光组的红 / 绿荧光比值最高，进一步证明其治疗效果最佳。此外，使用 2,7 - 二氯二氢荧光素二乙酸酯（DCFH-DA）评估不同处理下细胞内的 ROS 生成情况。在 750nm 和 808nm 激光照射下，用 CPN-PEG5k（50μg/mL）处理的细胞均显示出绿色荧光，表明有 ROS 生成。进一步地，为了阐明 CPN-PEG5k 诱导的细胞死亡途径，评估了 4T1 细胞与 CPN-PEG5k 及不同细胞死亡抑制剂共孵育后的活力。MTT 检测结果显示，与未添加细胞死亡抑制剂的对照组相比，细胞焦亡抑制剂（Ac-YVAD-cmk）、自噬抑制剂（3-MA）、铁死亡抑制剂（Fer-1）和坏死性凋亡抑制剂（Nec-1）对细胞活力的影响不明显。而细胞凋亡抑制剂（Z-VAD-FMK）是唯一能显著提高细胞活力的抑制剂。为了进一步证实这一点，用 Annexin V-FITC/PI 染色后，通过流式细胞术分析 CPN-PEG5k 处理的 4T1 细胞的凋亡情况。在 808nm 激光照射下，用 CPN-PEG5k 处理的 4T1 细胞凋亡率显著增加，平均凋亡率为 55%。这些发现表明，细胞凋亡是 CPN-PEG5k 诱导细胞死亡的主要途径。细胞凋亡可进一步引发免疫原性细胞死亡（ICD），其特征是高迁移率族蛋白 B1（HMGB1）、三磷酸腺苷（ATP）的释放以及钙网蛋白（CRT）的外翻。CPN-PEG5k + 808nm 激光组的免疫荧光染色显示出明显的 HMGB1 泄漏和 CRT 暴露。ELISA 检测也显示，在 CPN-PEG5k + 808nm 激光处理的细胞培养基中，HMGB1 和 ATP 的泄漏量最高。这些结果表明，CPN-PEG5k 可诱导强烈的细胞凋亡和 ICD，有可能在体内引发免疫反应。
CPN-PEG5k 的体内抗肿瘤性能
受 CPN-PEG5k 显著的体外抗肿瘤效果的鼓舞，我们进一步在 4T1 荷瘤小鼠中研究了其体内治疗性能。在肿瘤接种 10 天后（肿瘤体积约为 100mm³），将小鼠随机分为 6 组（每组 n = 5）：PBS 组（I）、PBS + 750nm 激光组（II）、PBS + 808nm 激光组（III）、CPN-PEG5k 组（IV）、CPN-PEG5k + 750nm 激光组（V）和 CPN-PEG5k + 808nm 激光组（VI）。在第 0、2 和 4 天，将 CPN-PEG5k（200μL，180μg/mL）瘤内注射到荷瘤小鼠体内。照射组的小鼠在注射后 2 小时接受 750nm 或 808nm 激光治疗（200mW/cm²，2 分钟）。每隔一天监测肿瘤体积。典型的肿瘤图像和定量结果表明，CPN-PEG5k + 808nm 激光组的肿瘤受到显著抑制。激光照射后，肿瘤几乎完全消融，在监测期内未观察到明显复发。CPN-PEG5k + 750nm 激光组的肿瘤在第 14 天平均体积达到 69.9mm³，仍远小于 PBS 组（586.9mm³）。平均肿瘤重量也证实，接受 CPN-PEG5k + 激光治疗的小鼠肿瘤明显小于其他对照组。随后，进行苏木精 - 伊红（H&E）染色和 Ki67 免疫组化染色，以评估不同处理下肿瘤组织的坏死和增殖情况。CPN-PEG5k + 808nm 激光组的肿瘤坏死面积更大，增殖细胞更少，进一步证明了 CPN-PEG5k 的肿瘤消融作用。
结论
我们成功开发了一种新型近红外激活的一体化纳米平台 CPN-PEG5k，用于高分辨率近红外二区荧光成像和高效光疗。与通过两亲性 F127 纳米沉淀法合成的 F127@CPN 相比，CPN-PEG5k 的近红外吸收增强（红移 48nm），近红外二区荧光发射显著增强（提高 2.97 倍）。此外，与常用的吲哚菁绿（ICG）染料相比，CPN-PEG5k 具有更优异的光稳定性和亮度，能够实现荧光血管造影、器官灌注评估和生命体征监测等体内精确成像任务。同时，CPN-PEG5k 具有出色的光热转换效率（η = 58.6%）和活性氧生成能力，可在 4T1 荷瘤小鼠模型中通过有效的光热疗法（PTT）和光动力疗法（PDT）消融肿瘤。而且，体内研究表明，808nm 激光照射下的 CPN-PEG5k 可诱导强烈的免疫激活，抑制肿瘤生长和转移。总之，CPN-PEG5k 具有高亮度、优异的光稳定性和光疗性能，为肿瘤治疗以及其他疾病的诊断和追踪提供了一种有前景的方法。
参考文献
An all-in-one PEGylated NIR-II conjugated polymer for high-resolution blood circulation imaging and photothermal immunotherapy， Jiahao Zheng，Weian Zhang*，Bin Wu, Fengxiang Xu, Tongtong Shan , Xiuyi Li, Jia Tian， Biomaterials 317 (2025) 123107 ，https://doi.org/10.1016/j.biomaterials.2025.123107
