内容提要
本文通过将双创新黄嘌呤与连续延伸的聚甲基桥偶联，有效地开发了五种新型NIR-II染料（BHs），使其在890至1206 nm的范围内具有强吸收，比具有相同聚甲基的传统菁染料长400 nm。更重要的是，在1064 nm激光照射下，BH 1024具有较高的共振特性和较好的激发态能量居群，具有较好的单线态产氧能力，光热加热适中，荧光明显。此外，bh1024被包裹在叶酸功能化聚合物中，在体外和体内均表现出协同的PDT/PTT效应，最终在NIR-II荧光引导下实现实体肿瘤消除。据目前所知，这是第一次探索和设计NIR-II PDT或NIR-II PDT/PTT小分子染料。
BH染料的基本光谱性质
BH染料的π-部分大，电子离域高，在NIR-II区表现出强烈的吸收。BH 890、BH 990、BH 1024、BH 1160和BH 1206在DCM中的吸收最大值分别为889、981、1019、1160和1206 nm，属于S0→S1跃迁。与含有相同多甲基的吲哚菁染料相比，BH染料在吸收光谱上表现出明显的红移（≈400 nm）。例如，bh1206的最大吸收波长（1206 nm）比典型的Cy7 （773 nm）长433 nm由于高共振结构和电子通信，所有BH染料都具有较高的摩尔消光系数（ε≈105 M−1 cm−1 )。特别是BH 1024显示出高ε值，约为1.4 × 105 M−1 cm−1，表明其具有出色的NIR-II光捕获能力。此外，BH染料在NIR-II区域表现出强烈的荧光，最大发射中心分别为928、1015、1070、1209和1273 nm，预测了它们在NIR-II荧光成像中的潜力。
NIR -I和II光激发下体外1O2生成和光热性质的评价
以1,3-二苯基异苯并呋喃（DPBF）为捕集剂，对DMSO中1O2生成的可行性进行了实验验证。从图中的DPBF脱色曲线可以看出，在808 nm激光照射下，BH 890产生了显著的1O2，而在1064 nm光照射下，没有检测到1O2，因为BH 890在808 nm处有很强的吸收，而在1064 nm处几乎没有吸收。正如预期的那样，由于三重态能级远低于0.98 eV， bh1160和bh1206在任何波长下都不会诱导O2产生。相比之下，BH 990和BH 1024在808和1064 nm激光照射下都表现出明显的1O2生成，这是由于它们在这两个激发波长下具有足够的T1能级和较高的吸收效率。在808 nm激光激发下，以IR780为基准（1 O2量子产率0.127），测得bh990和bh1024在DMSO中的单重态氧量子产率分别为0.08和0.07。值得注意的是，在1064 nm激光激发下，黑洞1024比黑洞990产生O2的能力更强。除了在1064 nm处对BH 1024有更强的吸收外，结构刚度对提高三重态激发态的稳定性也起到了支持作用。对于黑洞1024，这两个因素共同作用，促进更多的能量从黑洞1024的T1态转移到O2。测定了所有BH染料的光热性能。在近红外激光照射后，温度迅速升高，在辐照过程中，BH染料的温度明显随浓度和激光功率的增加而升高（ΔT）。光热转换效率（η）分别为42.6%和41.3%。而BH 990则更高（50.9%和45.7%）。根据上述理论计算结果，黑洞1024的Eg小于黑洞990 (1.76 eV vs 1.81 eV)，更有利于将激发能转化为热能的非辐射弛豫。然而，BH 1024比BH 990更高的刚度可以在更大程度上限制IC过程，并对非辐射失活产生更大的抑制作用。因此，BH 1024光热转换能力略有降低是上述两方面的平衡所致。
BH 1024 NPs的制备、表征和性能
总体而言，BH 1024同时表现出较高的光热转换效率和氧光敏化效率，使其成为NIR-II光疗的最佳候选者。为了改善生物相容性和肿瘤蓄积，我们进一步将bh1024包封成纳米颗粒，并在纳米核外包裹DSPEPEG，以防止侵略并延长血液循环时间。BH 1024 NPs具有直径均匀在200 nm左右的球形形态，zeta电位在-19.0 mV，加上最外层的叶酸，这些都有利于其通过主动和被动靶向方式在肿瘤部位有效富集。随后，我们研究了这种组装如何影响光物理性质、光动力和光热性能。BH 1024 NPs由于H聚集，吸收峰向808 nm发生了明显的蓝移。但黑洞1024 NPs在1039 nm处仍保持了较强的吸收肩峰，表明黑洞1024分子在NPs中仍保持非聚集状态。用1064 nm光照射含有BH 1024 NPs和SOSG的混合物，SOSG荧光强度明显增强，验证了BH 1024在NPs中保持了光敏能力。以ICG为参考，测定bh1024nps在水中的单线态氧量子率为0.05。在没有封装的bh1024单独的情况下，由于这种疏水染料在水溶液中完全聚集，没有检测到光生成的1O2。然后，通过监测近红外激光照射下的温度变化来检测BH 1024 NPs的光热性能。BH 1024 NPs表现出明显的浓度和激光功率相关的温度升高，其在水溶液中的表现明显优于单独的BH 1024。此外，在五个加热-冷却循环中，BH 1024 NPs的温升保持不变，而BH 1024单独的ΔT急剧下降，表明BH 1024封装在NPs中的光稳定性得到改善。体外光稳定性试验也得出了类似的结论。令人惊讶的是，我们发现在1064 nm的辐照下，BH 1024 NPs的最大吸收从808 nm红移到1039 nm。这种吸收位移可能与NPs中BH 1024组装态的热诱导变化有关。由于大的共轭结构和高疏水性，NPs中的BH 1024倾向于通过π -π堆积形成h型聚集体。b2424nps的强烈光热效应会加剧分子运动，破坏表面-表面堆积，导致游离单体逐渐释放，从而随着光照出现明显的红移现象。令人鼓舞的是，这种光触发的红移将有利于光动力治疗，因为h聚集总是猝灭激发态，从而减弱PDT。
体外光致细胞毒性
BH 1024 NPs具有良好的体外光热和光动力学特性，促使我们探索其对癌细胞的光细胞毒性。首先，用BH 1024 NPs孵育4T1细胞，然后用激光照射检测细胞内ROS的有效生成。然后用MTT法进行光毒试验。正如预期的那样，bh1024nps确实以浓度和光剂量依赖的方式表现出对细胞生长的优越抑制。值得注意的是，在整个浓度范围内，1064 nm处理组比808 nm处理组表现出更高的光毒性。一般认为，纳米颗粒穿过细胞膜后，会进入溶酶体并释放溶酶体中的内容物。因此，极有可能释放出亲脂性较强的bh1024优先进入细胞内疏水核心，同时在光照下逐渐分解成更多单体。因此，在1064 nm处会出现持续增强的吸收，并导致1O2产量逐渐增加。此外，1064 nm激光照射下，BH 1024 NPs产生的ROS和局部热疗均可诱导细胞死亡。为了明确它们各自的贡献，我们设计了单独PDT、单独PTT和PDT+PTT组。在1064 nm照射下，单次PDT和PTT分别造成23.1%和68.2%的细胞死亡，说明PTT的毒性几乎是PDT的3倍。PDT/PTT同时处理可导致92.8%的细胞死亡，表明bh1024nps的光细胞毒性协同增强。808 nm激光治疗组也观察到协同PDT/PTT效应，并通过活细胞/死细胞染色实验进一步证实。“PDT+PTT”组可见明显的强红色荧光，而单独PDT或PTT组均可见绿色和红色荧光。这些成像结果证明PDT和PTT联合使用可以实现完全的细胞杀伤，而PDT或PTT单独使用则不能。
BH 1024 NPs体外深度穿透PDT及PTT性能
在NIR-II荧光成像引导光疗之前，研究了NIR-II光比NIR-I光的优越性。首先，在808 nm和1064 nm辐照下，用不同厚度的鸡胸组织覆盖bh1024nps，分别评估了DPBF的衰减和温度升高。808激光穿透增加的组织后，温度下降的趋势比1064 nm激光更快。1064 nm对DPBF的降解作用比808 nm对DPBF的降解作用更明显。在模拟的深层组织环境中，MTT试验进一步验证了NIR-II光疗的优势。808 nm激光处理组细胞活力高于1064 nm激光处理组。明显地，当细胞被一块4 mm的组织覆盖时，808 nm组的存活率是1064 nm组的两倍。这些结果都强调并证实了深穿透的bh1024的NIR-II光疗效果优于NIR-I。
体内NIR-II FL成像引导PDT和PTT双模态治疗
在对小鼠进行光疗之前，根据标准溶血分析对体内细胞毒性进行表征。显然，bh1024或bh1024 NPs （100 × 10-6和200 × 10-6 M）处理的新鲜大鼠血液未见溶血现象，且溶血率均保持在2%以下，说明其血液相容性良好。接下来，我们通过静脉注射的方法研究了bh1024nps在4T1荷瘤BALB/c小鼠体内的肿瘤积累和生物分布。肿瘤中bh1024nps的NIR-II荧光随时间明显增强，在注射后20 h达到最大。相反，bh1024 （0.5% Tween 80溶液）主要位于肝脏和脾脏。具有代表性的离体肿瘤图像进一步证明了BH 1024 NPs的高效肿瘤特异性摄取和保留。这些结果表明BH 1024 NPs可以有效地在肿瘤中积累，并支持NIR-II荧光成像引导的光疗。血液循环曲线显示，bh1024nps的药代动力学符合两室模型，半衰期分别为t1/2(α) = 1.2±0.1 h和t1/2(β) = 19.3±2.4 h，表明该纳米颗粒可快速从血浆中清除。
由于BH 1024 NPs具有良好的体外PDT和PTT性能以及良好的体内肿瘤靶向性能，以及1064nm光的深层组织穿透性，我们在皮下4t1 -荷瘤小鼠模型上评估了其抗癌功效。静脉注射PBS或BH 1024 NPs(100µL, 200 × 10-6 m) 20 h后，肿瘤暴露于808或1064 nm激光（1.0 W cm−2）下。首先，我们测试了BH 1024 NPs产生的ROS在肿瘤内的分布。肿瘤上下部载玻片共聚焦成像显示，1064 nm照射肿瘤的DCF绿色荧光比808 nm照射肿瘤的DCF绿色荧光更强，这表明1064 nm激发在更深的组织中产生更多的ROS。
近红外激光器评估BH 1024 NPs的体内光热性能。808或1064 nm照射10 min后，肿瘤温度迅速升高至约50℃。光疗后，每2天监测和测量小鼠的体重和肿瘤体积，系统评价其抗癌效果。如图所示，小鼠注射2424nps和808 nm激光照射后，肿瘤抑制效果明显，但出现轻微复发。值得注意的是，1024nps和1064nm激光治疗的小鼠肿瘤完全消除，没有复发，这表明1064nm比808nm更有效。根据上述808和1064 nm激光引起的体内ROS和热疗，1064 nm组产生的ROS多于808 nm组，而两组之间的温升无明显差异。数据提示，1064 nm组的肿瘤根除可能是由于PDT效应增强所致。穿透肿瘤较深的NIR-II光强度不足以产生足够的热量，但仍能产生一定量的ROS杀死残留细胞。为了进一步验证我们的猜想，我们选择了BH 1024和BH 1160进行肿瘤内注射治疗。在相同的实验条件下，BH 1024组可以完全消除肿瘤，而BH 1160组在治疗后第6天出现了明显的肿瘤复发。此外，在治疗后肿瘤体积观察的早期，我们发现复发肿瘤开始从远离皮肤的部位开始疯狂生长。这些实验结果再次证明了NIR-II PDT在根除肿瘤中发挥了关键作用。因此，在NIR-II中同时进行PDT和PTT治疗，不仅比NIR-I区域延长了固有的光穿透，而且打破了NIR-II PTT的治疗极限。
总结
通过引入刚性黄嘌呤片段作为菁菁染料的偶联核心，我们成功构建了一个新的NIR-II染料家族（BHs），并对其作为多功能PAAs的潜力进行了深入的研究。黄嘌呤单位的高刚性特性不仅使BHs在NIR-II区域具有明显的红移，而且有助于在NIR-II荧光、PTT和PDT效应之间实现完美的平衡。将铅染料bh1024制备成叶酸修饰的聚合物NPs，该聚合物具有增强的光稳定性、水溶性和肿瘤归家能力，对大实体瘤具有出色的体内光疗效果，这一点已被小鼠肿瘤的显著消融所证实。这是第一次真正意义上实现基于小分子PAA的NIR-II PDT效应。我们的设计理念不仅为NIR-II PAAs的发展提供了指导，也为通过NIR-II光疗治疗深部肿瘤开辟了新的途径。未来，我们将把BH 1024 NPs应用于NIR-II光疗和免疫治疗的联合治疗中，希望对实体瘤有更大的治疗效果。
参考文献
Tailored Engineering of Novel Xanthonium Polymethine Dyes for Synergetic PDT and PTT Triggered by 1064 nm Laser toward Deep-Seated Tumors， Hui Bian, Dandan Ma, Xinfu Zhang,* Kai Xin, Youjun Yang,* Xiaojun Peng,* and Yi Xiao*
