内容提要
我们成功地在肿瘤过表达酶γ-谷氨酰转移酶（GGT）的催化下，实现了聚集诱导发射光敏剂（(AIE-PS)）TBmA的肿瘤靶向聚集。TBmA- glu可被GGT激活，通过裂解γ -谷氨酰键释放TBmA。TBmA的水溶性差导致其聚集，从而导致聚集增强的发射和光动力活性。TBmA-Glu不仅通过GGT光降解诱导谷胱甘肽（GSH）耗竭，还通过光动力治疗引发肿瘤细胞脂质过氧化积累和铁死亡。最后，雌性小鼠异种肿瘤移植和原位肝癌模型的体内研究也证明了TBmA-Glu具有显著的抗癌作用。这种可由GGT激活的AIE-PS所显示的卓越的癌症靶向能力和治疗效率，突出了酶介导的调节是调节细胞内小分子聚集的有效途径，从而推进了各种疾病的创新治疗策略。
合成与光物理性质
以4,7-二溴苯并[c][1,2,5]噻二唑为原料，分别与4（二苯胺）苯硼酸和相应的氨基苯基硼酸连续两次铃木反应合成了TBmA和TBpA。将TBmA或TBpA与boc - l -谷氨酸1-叔丁基酯偶联，经tfa催化脱保护反应得到TBmA- glu和TBpA- glu。研究了TBmA- glu、TBmA、TBpA- glu和TBpA在甲醇和磷酸盐缓冲溶液（PBS）中的光物理性质。所有化合物在甲醇中均在450nm处出现最大吸收峰，并在PBS中出现轻微的红移。所有化合物在水中的排放强度都比在甲醇中强得多，这表明它们具有潜在的AIE活性。然后进一步研究了这四种化合物的AIE性质。结果表明，TBmA是一种典型的AIE发光物质（AIEgen），在N，N-二甲基甲酰胺(DMF)/水溶液中，随着水分数（fw）的增加，其发光强度增强，同时表现出较强的固体粉末发光。而TBmA- glu仅表现出固态发光，在DMF溶液中加水不能引起其聚集并诱导发光增强。这表明glue - moy修饰赋予TBmA优越的水溶性，这有利于去除生理条件下导致背景发光的非特异性聚集。同样，TBpA和TBpA- glu表现出与TBmA和TBmA- glu相同的AIE特征。
研究了这四种化合物在PBS中产生活性氧（ROS）的能力。研究发现，TBmA和TBpA产生的活性氧明显高于TBmA- glu和TBpA- glu，甚至超过了商用光敏剂Rose Bengal （RB）。此外，TBmA被认为是四种化合物中最有效的光敏剂。进一步分析表明，TBmA和TBpA是强I型光敏剂，而TBmA- glu和TBpA- glu是非常弱的II型光敏剂。虽然经过/未经过glu修饰的ae -PS光动力过程不同的原因尚不清楚，但研究结果强调了PS结构对光动力活性的显著影响。虽然TBmA和TBpA在聚集状态下表现出聚集增强的ROS生成能力，但在高浓度DMF （fw < 40%）的溶液中，它们无法产生任何可检测水平的ROS。这些结果表明，TBmA和TBpA在分子状态下不是有效的光敏剂，但在聚集状态下获得ROS生成能力。
我们使用TBmA研究了ROS生成、AIE排放和团聚粒径之间的相关性。我们发现，在低含水量（fw < 60%）下，增加的含水量不会诱导TBmA聚集，我们无法检测到任何排放或ROS Article https://doi.org/10.1038/s41467-024-54291-1的产生。然而，当fw达到约60%时，TBmA开始聚集，导致排放和ROS生成增加。排放强度在fw≥80%时达到峰值，随后随着fw的增加而降低，而ROS的生成则持续增加而不减少。团聚体粒径在达到最大值80%后开始减小，其变化趋势与排放强度相似。纳米颗粒尺寸的减小导致表面积的增加，促进纳米颗粒表面的PS分子与周围分子之间的相互作用，从而促进有效的光动力过程。考虑到发光和ROS生成之间对激发光吸收能量的竞争，ROS生成的增加将导致发射强度的降低。此外，TBmA聚集体表现出优异的长期稳定性和光动力稳定性，在FBS（胎牛血清）溶液中分散72小时或光照30分钟后没有发现明显的聚集或降解。总之，TBmA不仅具有AIE特性，而且具有聚集增强的ROS生成，这些优异的特性使其成为治疗应用的合适材料。如果能够实现TBmA在癌细胞中的靶向聚集，那么TBmA的聚集诱导发射和光动力活性不仅有利于肿瘤的追踪，而且可以实现靶向治疗。
GGT激活休眠AIE-PS
在我们的研究中，精心设计的休眠AIE-PS TBmA- glu可以在GGT存在下转化为活性AIE-PS TBmA，从而诱导TBmA聚集。TBmA的聚集体已被证明在光照射下具有强大的ROS生成活性。因此，我们随后探索了GGT诱导TBmA-Glu聚集的潜力。对接结果显示，TBmA-Glu可以与GGT活性口袋中的氨基酸残基（ARG-327、ASP-422、ph -424和ASN-431）相互作用。测定TBmA-Glu的抑制剂常数（Ki值）为0.17 μM，低于TBpA-Glu和谷氨酸，表明TBmA-Glu与GGT具有较强的亲和力。随后，研究了GGT存在下TBmA-Glu的发光变化。在TBmA-Glu和GGT共孵育后，观察到发光强度显著增加，表明TBmA-Glu的-Glu部分成功切割。为了验证发光增强是否由TBmA诱导，对TBmA- glu和GGT共孵育2小时后得到的产物进行了液相色谱-质谱分析。发现了一个与纯TBmA保留时间和m/z值相同的产物（m/z = 471.2）。这些发现为GGT能够将休眠的AIE-PS （TBmA- glu）转化为活性状态（TBmA）提供了证据。我们通过动态光散射和透射电子显微镜（TEM）研究了GGT催化反应（12 h）过程中形成的TBmA聚集体的变化。DLS结果显示，在最初的4小时内，聚集体的大小逐渐增加到~158.0 nm。随后，孵育4小时后达到稳态大小，即使将孵育时间延长至12小时也未观察到进一步的变化。TEM分析显示，GGT促进了球状TBmA聚集体的形成，平均直径为~100 nm 。此外，对稳定TBmA聚集体的总ROS生成特性的评估表明，在15分钟的光照后，它诱导DCFH强度增加了约164倍。虽然这种增强略低于99% PBS形成的聚集体（188倍），但明显高于Rose Bengal（67.0倍）。这些发现与先前的观察结果一致，即较小的聚集体尺寸倾向于光动力效率的提高。我们的研究结果表明，由GGT产生的TBmA聚集体具有强大的光动力活性。考虑到GGT是谷胱甘肽（GSH）稳态的关键酶，高水平的GGT可以减轻癌细胞的氧化应激。我们随后研究了ttbma - glu对GGT活性的影响。结果表明，高浓度的TBmA-Glu （5 μM）可以显著抑制GGT的催化活性，而不依赖于光照射。这可能归因于TBmA- glu对GGT的强亲和力和TBmA的聚集，这可以阻止底物进入酶的活性口袋。此外，在光照射下，低浓度的TBmA- glu （2 μM）会使GGT的催化活性急剧下降。这表明，裂解产物TBmA可以通过光动力活性产生ROS，在GGT附近积累，诱导GGT功能的原位损伤。
随后的研究进一步证明了TBmA-Glu对过表达ggt的癌细胞的广谱抗癌潜力，包括OVCAR-5和小鼠4T1癌细胞。光动力治疗的IC50值分别为5.13±0.69 μM （OVCAR-5）和5.28±1.56 μM （4T1）。此外，在正常表达GGT的HLF-1细胞中，没有观察到明显的光细胞毒性，也没有观察到明显的暗细胞毒性。因此，在光照射下促进细胞产生ROS。有趣的是，在TBmA-Glu暗处理组中观察到轻微的绿色荧光，这可能是由于GGT活性受到抑制。由于GGT在癌细胞产生GSH以缓解氧化应激中起重要作用，抑制GGT活性会导致ROS水平升高。随后，PDT过程中产生的ROS被ROS清除剂识别。流式细胞术分析显示，以TBmA-Glu （2 μM）加辐照处理的HepG2细胞为对照，用NaN3和Tiron（分别为1O2和O2−特异性清除剂）预孵育的细胞仅引起DCF荧光强度的轻微降低。与此相反，用Trolox （ROO·特异性清除剂）和d -甘露醇（·OH特异性清除剂）预孵生可有效抑制DCF荧光的产生，表明脂质过氧化和·OH是tma - glu PDT诱导ROS的绝大部分原因。使用不饱和脂质1,2-二油基-锡-甘油-3-磷酸乙醇胺（DOPE）和脂质过氧化测定试剂盒进一步证实了TBmA在体外和活细胞中的脂质氧化作用。在DOPE/TBmA混合物和光照后的细胞中也检测到DOPE的过氧化产物和脂质过氧化产物丙二醛（MDA）。高水平的谷胱甘肽不仅有助于消除癌细胞代谢过程中产生的ROS，还有助于癌细胞克服药物诱导的ROS应激，从而获得耐药性。谷胱甘肽水平与GGT功能密切相关。因此，我们检测了TBmA-Glu （2 μM）处理HepG2细胞中氧化谷胱甘肽（GSSH）与还原性谷胱甘肽（GSH）的比值变化。在TBmA-Glu +光处理下，观察到GSSG/GSH比值的时间依赖性增加，这是由于TBmA-Glu介导的PDT诱导的ROS和GGT损伤。此外，我们通过western blotting和免疫荧光分析证实了TBmA-Glu对GGT活性的有害影响，结果显示PDT处理后HepG2细胞中GGT水平下降。这意味着GGT的催化作用导致TBmA的积累，TBmA反过来通过产生ROS对GGT造成损害。此外，在黑暗条件下长时间孵育导致GSSG/GSH比率增加，这再次归因于聚集TBmA对GGT的抑制。上述结果表明，TBmA-Glu可通过光动力效应诱导HepG2细胞脂质过氧化积累和GSH消耗。由于GPX4利用GSH作为底物，在清除脂质过氧化过程中起着至关重要的作用，作为细胞铁凋亡的主要抑制剂，我们研究了TBmA-Glu对HepG2细胞中GPX4表达水平的影响。与对照组相比，TBmA-Glu +光处理后GPX4水平显著降低。此外，透射电镜显示细胞形态的改变，包括TBmA-Glu +光处理细胞中线粒体萎缩和双层密度增加，这是铁下垂的标志。然而，在核形态上没有观察到明显的变化。这些结果表明，TBmA-Glu通过光动力活性抑制和损害GGT，导致氧化应激、脂质过氧化积累和GPX4水平降低，最终导致HepG2细胞铁死亡。
体内PDT疗效
由于TBmA-Glu具有良好的抗癌作用，我们在HepG2异种移植裸鼠模型上进一步评价了TBmA-Glu的体内光疗效果。结果表明，与TBmA相比，静脉注射TBmA- glu （5 mg/kg）在肿瘤区域选择性激活12 h。此外，在治疗过程结束时，TBmA-Glu治疗组的肿瘤体积较其他组明显减小。苏木精和伊红（H&E）染色结果也证实了TBmA-Glu的抗癌PDT效果明显高于其他组。同时，免疫组化（IHC）结果验证了TBmA-Glu诱导癌细胞铁凋亡的光动力学效应。值得注意的是，在TBmA-Glu治疗小鼠的过程中，没有出现明显的体重减轻或器官损伤，表明其具有良好的生物相容性和肿瘤选择性。相比之下，TBmA治疗组小鼠的体重明显减轻，肝脏损伤明显，这是由于TBmA具有强大的光动力活性，但肿瘤选择性较低。将荧光素酶报告细胞HepG2 （HepG2- luc）注入裸鼠肝脏，建立原位肝癌模型。以5 mg/kg的剂量静脉给予TBmA-Glu， 12 h后进行微创PDT和体内成像。TBmA-Glu发光和荧光素荧光在HepG2细胞中良好的共定位提供了令人信服的证据，支持TBmA-Glu作为一种有前途的肿瘤跟踪工具的优势。。此外，PDT组荧光强度的降低表明TBmA-Glu对原位肝癌有抑制作用，癌组织的H&E染色、TUNEL染色和IHC-Ki67染色结果进一步支持了这一结论。这些结果表明，ttbma - glu在原位肝癌模型中具有显著的PDT效果。
总结
我们开发了一种高效的AIE-PS，命名为TBmA-Glu，它可以被GGT激活。与传统的AIE-PS不同，TBmA-Glu可溶于水，并以分子形式存在于水溶液中。当TBmA-Glu中的水溶性Glu部分被GGT切割时，它会引发不溶性TBmA的聚集。通过利用肿瘤过表达GGT的“Glu”片段识别特性和GGT的“Glu”裂解催化活性，我们实现了AIE-PS的肿瘤靶向聚集。TBmA的聚集导致辐射增强和光动力活性增强。TBmA-Glu介导的PDT过程不仅破坏GGT，导致GSH耗损，还通过脂质过氧化诱导和GPX4下调诱导癌细胞铁凋亡。因此，HepG2异种移植瘤和原位肝癌模型均表现出良好的靶向效率和PDT效果。总的来说，这些结果强调了TBmA-Glu作为肿瘤治疗的临床光敏剂的重要前景。酶介导的调节策略也被证明是实现细胞内小分子聚集过程调控的有效途径。
参考文献
Enzymatically catalyzed molecular aggregation， Wen-Jin Wang, Rongyuan Zhang, Liping Zhang,LiangHao,Xu-Min Cai ,QianWu, Zijie Qiu，Shaojuan Wang , Parvej Alam,RuijuanHan1,JingFeng, Guoqing Zhang， Ben Zhong Tang ， Nat. Commun| (2024) 15:9999， https://doi.org/10.1038/s41467-024-54291-1
