内容提要
本文介绍了一种先进的治疗探针，它集成了可激活的第二近红外（NIR-II）荧光成像，用于精确诊断RA和多管齐下的RA治疗。合成了一种由长波长聚集诱导发射单元和锰羰基笼基基构成的新型分子探针，可在炎症关节微环境中激活NIR-II荧光并同时释放治疗性一氧化碳（CO）气体。该分子探针可自组装成生物相容性纳米探针，随后与抗IL - 6r抗体偶联，提供RA的活性靶向能力。纳米探针在RA病变处显示出明显的NIR-II荧光信号，可实现高灵敏度的RA诊断和实时治疗监测，清除ROS、按需释放CO气体、阻断IL-6信号联用，具有较强的治疗效果和协同免疫调节作用，可显著缓解RA症状，防止关节破坏。
分子探针的设计与光物理性质研究
我们设计并合成了一种新型NIR-II荧光基团与羰基锰偶联的治疗性分子探针，该探针有望在ROS存在下释放CO并激活FL。核心结构为含联吡啶的给受体（D-A）型荧光团，能与羰基锰配位，通过光致电子转移效应导致FL猝灭。采用辛氧基取代三苯胺（OTPA）作为D单元，具有较强的给电子性和较高的溶解度。A单元为噻二唑喹诺啉（TQ）基团与1,10-菲罗啉的熔合，不仅能增强吸电子能力，延长偶联长度，还能与羰基锰提供配位。三丁基丁取代OTPA与二溴二硝基苯[c]噻二唑通过still -偶联反应合成二硝基化合物，然后与1,10-菲罗啉-5,6-二酮进行铁催化剂还原反应，缩合成环，得到近红外发色团TT。随后与Mn(CO)5Br配位生成所需分子TTCO。中间体和最终产物的详细合成和表征如图所示。我们研究了分子探针的ros响应NIR-II FL激活和CO释放特性。暴露于活性氧后，预计探针将经历脱配过程以释放荧光团和CO。高分辨率质谱（HRMS）测量证实了H2O2处理后TTCO转化为TT。因此，我们比较了TTCO和TT分子的光物理性质。TTCO和TT在近红外区和NIR- II波段均有明显的吸收，最大发射波长在1000 nm以上。TT的NIR-II FL强度明显强于TTCO。考虑到将疏水分子探针应用于生物纳米平台的必要性，我们研究了它们在不同聚集状态下的发射特性。随着THF/水混合溶剂体系中水（坏溶剂）分数（fw）的增加，TTCO的FL强度不断降低。相反，TT的FL强度先降低后增强，表现出明显的AIE特征。这些结果表明，ROS刺激可以将TTCO分子转化为TT，产生较强的NIR-II FL和AIE效应，有利于实现NIR-II FL的灵敏成像。为了获得水溶性生物相容性纳米颗粒（NPs），采用纳米沉淀法将疏水分子探针TTCO包封并稳定，采用1,2二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺- n-[甲氧基（聚乙二醇）-2000]（DSPE-PEG）。为了促进对RA的特异性富集，我们进一步通过巯基-马尔加成反应将抗il - 6r抗体偶联到TC NPs表面，得到TC@AI NPs。抗IL-6R抗体已被FDA批准用于RA的靶向治疗，它可以特异性结合RA病变中免疫细胞表面过表达的IL-6R。作为对照，制备了核心无分子探针修饰的空白NPs （AI NPs）抗il - 6r抗体。根据动态光散射（DLS）分析，TC NPs、AI NPs和TC@AI NPs具有相似的平均尺寸，范围在115 ~ 125 nm之间，并表现出负的zeta电位。透射电子显微镜（TEM）图像显示TC@AI NPs具有球形形貌，使用能量色散x射线能谱（EDS）进行元素映射分析进一步证实了碳(C)、氧(O)、氮(N)和锰（Mn）的均匀分布。此外，micro-BCA分析测量了TC@AI NPs上靶向抗体的含量，证明了抗il - 6r抗体在TC@AI NPs表面的成功结合。TC@AI NPs在暴露于H2O2后在吸收光谱中表现出轻微的下色偏移，这是由于吸电子锰配合物的解理。进一步评估H2O2暴露后纳米探针的荧光发射，发现NIR-II荧光信号明显增强，并在≈1070 nm处出现新的荧光峰。此外，我们观察到NIR-II FL信号强度随着H2O2浓度的增加而增加，表明NIR-II FL信号与ROS浓度呈正相关。在确认ros触发的NIR-II FL特性后，我们继续使用血红蛋白作为探针来检测CO气体的原位生成。
活化NIR-II成像和按需CO释放在细胞水平
增加的ROS水平通过加剧细胞内的促炎途径在驱动炎症反应中起重要作用。在细胞摄取研究之后，我们进一步研究了TC@AI NPs是否能敏感地检测活细胞内的ROS。RAW264.7巨噬细胞首先用LPS和IFN- <s:1>刺激ROS生成，然后用各种配方孵育。作为对照，未经促炎刺激的幼稚巨噬细胞也暴露于TC@AI NPs。孵育4 h后，在NIR-II荧光显微镜下观察纳米探针的细胞内荧光信号。在TC@AI NPs处理的活性巨噬细胞中，NIR-II FL信号（808 nm激发，1100 nm发射）显著增强。相比之下，TC@AI NPs在幼稚巨噬细胞中仅发出微弱的NIR-II信号。在“LPS + IFN- <s:1>”刺激和TC@AI NPs孵育的细胞中，NIR-II FL信号比TC@AI NPs处理的正常巨噬细胞高5.8倍，表明ROS激活了NIR-II FL信号。此外，由于靶向能力增强，用TC@AI NPs孵育的炎症细胞表现出比用TC NPs处理的细胞高1.9倍的NIR-II FL强度。在确认TC@AI NPs的ROS点亮成像能力后，我们使用2 ‘ 7 ’二氯二氢双乙酸荧光素（DCFH-DA）染色评估其与细胞内ROS反应和清除能力。DCFH-DA与ROS反应后可由非荧光化合物转化为具有绿色荧光的2 ',7 ' -二氯荧光素（DCF）。如图4f所示，在LPS和IFN- <s:1>刺激下，RAW 264.7细胞的ROS生成显著增加，DCF的强烈绿色FL证明了这一点。正如预期的那样，TC NPs和TC@AI NPs在细胞水平上都表现出有效的ROS清除能力，这源于它们有利的ROS反应特性。值得注意的是，TC@AI NPs具有增强的靶向能力，表现出更明显的ROS消耗作用。然后用流式细胞术定量细胞内ROS信号。与未激活的巨噬细胞相比，炎症巨噬细胞中DCF的FL强度增加了约26.9倍。随后用TC NPs或TC@AI NPs处理12小时，ROS FL强度分别降低约3.8倍和13.2倍。
细胞水平的炎症抑制和免疫调节
我们通过测量促炎细胞因子的细胞分泌水平，包括肿瘤坏死因子-延迟（TNF-延迟）和IL-6，来评估TC@AI NPs的抗炎活性。在类风湿性关节炎微环境中，这些细胞因子过量产生，促进疾病进展。与未处理的天然巨噬细胞相比，ELISA分析显示活化巨噬细胞上清液中IL-6和TNF- rp水平显著升高。值得注意的是，TC@AI NPs组在所有治疗组中表现出最低的这些炎症细胞因子浓度，与其他配方处理的活化巨噬细胞相比，IL-6水平低1.5至3.1倍，TNF- ρ水平低1.9至7.1倍。治疗后检测抗炎因子IL-10、TGF-时延。结果显示，与其他组相比，TC@AI NPs处理的活化巨噬细胞显示出更高水平的这些抗炎细胞因子。这些结果表明TC@AI NPs，整合了ROS清除，CO气体生成和IL-6R阻断，有效地减轻了这些炎症细胞因子。由于Mn2+离子已经被报道可以激活sting相关免疫，我们下一步研究纳米探针是否可以诱导sting介导的免疫应答。当细胞与纳米探针（25 μg mL−1基于TTCO）或0.88 μg mL−1的Mn2+（相当于25 μg mL−1 TTCO中Mn2+的含量）直接孵育时，我们测量了由STING激活触发的关键促炎细胞因子IFN- 1的水平，与pbs处理的对照细胞相比，未观察到显著增加。这些结果表明，在我们的系统中，STING的激活是最小的。虽然有Mn2+诱导的STING激活的报道，但它通常需要相对高浓度的Mn2+和STING激动剂的存在。这些发现表明，我们的探针中的低Mn2+水平不足以有效触发STING途径。巨噬细胞是滑膜中主要的免疫细胞类型，通常分为M1型和M2型。越来越多的证据表明，RA患者的关节通常含有大量活跃的m1极化促炎巨噬细胞，同时较少或不活跃的m2型细胞。这种巨噬细胞稳态失衡显著促进免疫激活和加速组织重塑。因此，促进巨噬细胞从促炎M1表型到抗炎M2表型的再极化成为一种有希望的RA治疗策略。我们随后探索了TC@AI NPs诱导巨噬细胞复极化的潜力。免疫荧光染色显示正常巨噬细胞不明显表达iNOS （M1巨噬细胞表面标记物）和CD206 （M2巨噬细胞表面标记物），表明它们主要处于失活状态。然而，在LPS和IFN- <s:1>刺激下，iNOS的普遍表达表明巨噬细胞向M1表型极化。有趣的是，将炎症的RAW 264.7细胞与TC NPs、AI NPs或TC@AI NPs共孵育，观察到inos阳性细胞数量明显减少，cd206阳性细胞数量增加，尤其是TC@AI NPs处理的细胞。进一步通过Western blot检测巨噬细胞中iNOS和CD206的表达，发现了相似的趋势，TC@AI NPs组iNOS水平最低，CD206表达最高。这些发现共同表明TC@AI NPs可以作为一种有效的调节剂，促进巨噬细胞从M1向M2的表型转变。我们研究了TC@AI NPs抗炎和免疫调节能力的机制。先前的研究表明，CO可以激活HO-1的表达，HO-1是一种在病理条件下维持细胞稳态的内源性抗氧化系统。我们用免疫荧光染色法评估细胞内HO-1水平。活化的巨噬细胞内TC@AI NPs按需释放CO导致HO-1表达显著增加。具体而言，与PBS、TC NPs和AI NPs处理的活化巨噬细胞相比，TC@AI NPs处理的活化巨噬细胞的HO-1蛋白表达分别高出4.1倍、1.4倍和3.6倍。通过western blotting分析进一步评估HO-1水平，也证实TC@AI NPs升高了HO-1在炎症巨噬细胞中的表达。为了提供CO抗炎特性的直接证据，我们使用独立的CO供体分子CORM-2来专门评估CO的作用。结果显示，CO明显上调HO-1表达和IL-10水平，同时降低促炎因子如TNF-时延和IL-1时延。然而，CO单独的炎症调节能力不如TC@AI NPs明显。这些发现表明，ROS抑制和CO的原位释放对于有效抑制炎症反应至关重要。此外，我们发现TC@AI NPs处理显著上调了p-Stat3、Hes1和Notch1的蛋白表达，与其他配方处理的细胞相比。这些结果表明TC@AI NPs可以激活HO-1和Notch/Hes1/Stat3信号通路，协同促进免疫细胞炎症的解决和抗炎表型的促进。我们进一步分析了TC@AI NPs减轻促炎信号的能力，ROS微环境可以触发促炎途径。LPS和IFN- <s:1>处理后，巨噬细胞p38 MAPK和NF-��B蛋白表达显著增加（p50/p65）。然而，用TC@AI NPs孵育炎症巨噬细胞导致p38和p50/p65表达明显下调。基于这些发现，图中阐明了TC@AI NPs引起的抗炎和巨噬细胞极化效应的潜在机制。
体内活化NIR-II FL成像
为了验证NIR-II FL在ros过表达炎症微环境中的实时激活，我们首先通过在小鼠右背区局部注射LPS建立了皮下炎症模型。lps注射12 h后，将TC@AI NPs直接注入炎症部位。作为对照，同样将同等剂量的TC@AI NPs皮下注射到未受影响的小鼠左侧（没有LPS诱导）。NP给药半小时后，使用特制的NIR-II成像系统对小鼠进行NIR-II成像。在808 nm光照射下，lps刺激部位在1100 nm处发出强烈的NIR-II FL信号，而健康部位仅表现出微弱的NIR-II信号。在定性上，注射TC@AI NPs后0.5 h炎症部位的NIR-II FL信号比健康对照部位高4.3倍。这一观察证实了炎症病变内ros应答纳米探针的实时激活，这种开启NIR-II成像将极大地促进炎症RA病变的准确和敏感成像。我们进一步将重点转向评估TC@AI NPs在CIA小鼠模型中的体内RA靶向和激活成像能力。CIA小鼠模型具有与人类类风湿关节炎相似的免疫学和病理学特征，使其成为研究类风湿关节炎发病机制和评估新疗法的广泛应用模型。根据文献，正常关节组织中的ROS水平维持在相对较低的水平，但炎症关节中的ROS水平可急剧升高（可高达100 μm）。在这里，我们收集了健康小鼠和RA模型小鼠的关节组织。组织匀浆，使用ROS敏感探针DCFH-DA评估关节匀浆中的ROS水平。我们的研究结果显示，与健康对照组相比，RA模型小鼠关节中的ROS水平显著升高。这些发现与先前的报告一致，支持利用RA微环境激活ros反应性治疗探针的基本原理。将RA小鼠随机分为三组，分别静脉注射PBS、TC NPs和TC@AI NPs，然后使用NIR-II成像系统成像。如图所示，注射PBS的小鼠爪子上的NIR-II FL信号可以忽略不计，说明NIR-II区域的背景噪声较低。相比之下，注射TC NPs的小鼠在RA关节处显示适度的NIR-II FL信号。缺乏靶向配体的TC NP可能通过炎症介导的增强渗透和保留（EPR）效应被动积累在RA病变中，这种现象最初在NP向肿瘤的递送中观察到，最近发现也发生在某些炎症性疾病中，值得注意的是，与注射TC NPs的小鼠相比，注射TC@AI NPs的小鼠在所有测试时间点的RA关节处显示出更亮的NIR-II FL信号，在注射后4小时，FL强度高1.7倍。这些结果提示抗il - 6r抗体修饰可增加关节炎关节内NP的积累。此外，与在注射TC@AI NPs的RA小鼠中观察到的明显的关节NIR-II FL信号相反，同样处理的健康小鼠仅表现出可忽略不计的NIR-II FL。这种差异归因于TC@AI NPs对健康关节的弱亲和力以及探针在非病理性微环境中的笼状状态。这些发现强调TC@AI NPs具有主动靶向和可激活开启成像的能力，可以精确区分健康小鼠和RA小鼠，促进RA的敏感和准确诊断。
总结
本研究介绍了一种先进的治疗平台，结合ros激活NIR-II FL成像进行RA诊断，具有多方面的治疗功能。我们的方法始于合成一种新型的长波长有机荧光团，由ros响应的锰羰基笼。在炎症关节微环境中，锰羰基被裂解，激活NIR-II FL信号，同时产生治疗性CO气体。在炎症ROS条件下，成像信号和治疗气体产生的协同激活使TTCO成为精确诊断RA和按需治疗的有希望的候选者。之前，我们报道了no激活的NIRI PA探针用于RA成像，使用地塞米松为基础的前药单独治疗RA。在这项工作中，这种新型分子探针不仅可以按需激活长波NIR-II荧光成像，还可以同时释放治疗性CO气体，用于协同治疗RA和局部免疫调节。
参考文献
Microenvironment-Activatable Probe for Precise NIR-IIMonitoring and Synergistic Immunotherapy in RheumatoidArthritis，Yuan Zhang, Dongfang Liu, Wenwen Chen, Yongyou Tao, Wen Li, and Ji Qi*， Adv. Mater. 2024, 2409661，https://doi.org/10.1002/adma.202409661
