内容提要
光疗作为一种新的癌症研究途径，在无创的光启动下实现实时诊断和同步原位治疗，显示出无穷无尽的旺盛生命力。然而，构建一种先进的材料，允许突出的光治疗输出并同步克服光治疗的固有缺陷，将是一项具有吸引力但具有重大挑战性的任务。本文巧妙地设计和制备了一种聚集诱导发射(AIE)主动发光材料(即DBD-TM)，该发光材料具有强烈的电子给体-受体强度和分子内运动精细调制的扭曲结构。DBD-TM同时具有第二近红外(NIR-II)区的荧光发射和高效的光热转换。通过将DBD-TM与抗血管生成剂索拉非尼(sorafenib)结合，制备了一种多功能纳米材料，并将其用于光热治疗和抗血管生成癌症的三模成像导航协同治疗。这种先进的方法能够提供准确的肿瘤诊断，完全消除肿瘤，并在很大程度上抑制肿瘤复发，显然是一种超越光治疗的突出治疗方案。这项研究将为开发新一代癌症治疗方法提供蓝图。
结果与讨论
分子合成与光物理性质
通过连接(E)-[3,3 ' -biindolinylidene] - 2,2 ' -dione (isoindigo)单元两侧的电子受体骨架，合理设计了具有不同电子给体-受体-给体(D-A-D)构型的DBD-P、DBD-T和DBD-TM化合物。测定了DBD-P、DBD-T和DBD-TM在四氢呋喃(THF)中的吸收光谱。如图1A所示，THF中DBD-P、DBD-T、DBD-TM的吸收峰分别以513、572、598 nm为中心，这与计算得到的gap值ΔE一致。其中，DBD-TM在660 nm处具有较强的吸收，摩尔吸收系数为1.9 × 104 m−1 cm−1。随后，我们测定了这些化合物的固态荧光。发现DBD-P、DBD-T和DBD-TM的最大发射波长分别为727、801和890 nm，化合物DBD-TM在NIR-II中也有较强的发射。发射波长的逐渐红移与D-A相互作用的逐渐增强有关，这与实验设计预期一致。DBD-P是典型的ACQ分子，而DBD-T和DBD-TM都具有AIE性能。对于DBD-TM，在低含水量(fw < 40%)的体系中，荧光强度随fw的增加呈下降趋势。这种现象很可能是由该化合物的分子内电荷转移(TICT)扭曲引起的，通过测量其溶剂致色性进一步证明了这一点，随着极性溶剂的增加，荧光发射逐渐减小，最大发射波长发生红移。该体系中fw大于50%时，其荧光强度随fw的增加而增强，这是由于聚集物的形成限制了其分子内运动，显示出典型的AIE特征。而且，DBD-TM的增强率大于DBD-T。由于其在NIR-II地区的AIE倾向和长排放尾，对DBD-T和DBD-TM进行了进一步的评价。以ICG为参考，测定DBD-T和DBD-TM在THF中的量子产率(QYs)分别为0.246%和0.063%。在功率密度为0.3 W cm−2的660 nm激光照射DMSO时，对DBD-T和DBD-TM的光热转换效率进行了评估。如图所示，随着AIEgen浓度或功率密度的增加，温度逐渐增强，其最高温度可提高60-70℃，表明其具有良好的光热性能，在光疗方面具有潜在的应用前景。此外，无论浓度变化还是功率密度变化，DBD-TM的光热转换能力都优于DBD-T。值得注意的是，在660 nm激光照射下，DBD-T和DBD-TM经过5个连续加热/冷却循环后，其光热转换效果都保持了细微的变化，表明其具有较高的光稳定性，这是著名光疗剂的重要特性之一。
体外协同治疗
为了观察TS NPs在细胞中的分布，将sorafenib和DBD-TM包被异硫氰酸荧光素标记的两亲共聚物(DSPE-mPEG2000-FITC)提供FITC@TS NPs，然后将其与商业Lyso Tracker Deep Red染料在细胞中共孵育。荧光共聚焦显微镜观察发现，FITC@TS NPs中FITC的绿色荧光与商用Lyso Tracker Deep red染料的红色荧光有很好的重叠， Pearson相关系数为82%，进一步表明FITC@TS NPs可以通过细胞内吞作用靶向溶酶体。采用MTT法和活细胞染色法研究纳米材料对4T1细胞的细胞毒性。首先，在索拉非尼NPs存在的情况下，细胞毒性评价结果显示，随着索拉非尼NPs浓度的增加，细胞存活率逐渐下降，计算出的IC50值为37.68 μm，表明索拉非尼可以作为一种杀伤肿瘤的药物。对于DBD-TM NPs，在黑暗中观察到较低的细胞毒性，表明其具有良好的生物相容性，而在激光照射(660 nm, 0.3 W cm−2,5 min)时出现浓度依赖性的细胞毒性， IC50值为45.08 μm，显示其在肿瘤杀伤方面的潜在应用价值。随后对细胞进行Calcein-AM/PI染色实验。对于DBD-TM NPs，在50 μg mL−1的浓度下，黑暗条件下几乎没有凋亡细胞出现，但在激光照射(660 nm, 0.3 W cm−2,5 min)下，出现大量凋亡细胞，活细胞比例下降。然而，当浓度达到100 μg mL−1时，在黑暗条件下出现凋亡细胞，但在相同的激光照射下几乎所有细胞都发生凋亡，进一步验证了光疗的效果。最后，系统地研究了TS NPs的浓度依赖性细胞毒性。实验结果表明，在激光照射(660 nm, 0.3 W cm−2,5 min)下，TS NPs中所含索拉非尼和DBD-TM的IC50值分别为18.18和3.61 μm，远低于其独立存在时的IC50值。
体内成像和协同治疗
受TS NPs在体外良好的光疗效果启发，我们进一步评估了TS NPs在体内的治疗效果。前期通过小鼠尾部静脉注射TS NPs，实时监测NIR-II荧光成像。注射TS NPs后3 h，肿瘤部位荧光信号有增强的趋势，且随着时间的推移，肿瘤部位荧光强度逐渐增强，说明TS NPs可以通过EPR效应在肿瘤部位有效积累。注射24 h后，肿瘤区域的荧光信号达到平稳期，信噪比(SNR)为8.90，之后随着时间的推移，信号逐渐下降。48 h后解剖小鼠，分离主要脏器和肿瘤，用NIR-II FLI进一步评价TS NPs的生物学分布。我们发现肿瘤组织区域内的荧光信号仍然很强，说明TS NPs可以在肿瘤区域内实现长期滞留，在NIR-II FLI引导下的手术导航中具有很大的应用潜力。值得注意的是，肝脏区域的荧光信号是在48 h后TS NPs逐渐代谢的结果。然后用荷瘤小鼠评价TS NPs的体内光热效应。注射24 h后，用660 nm (500 mW cm−2)激光照射小鼠肿瘤区域10 min，并监测肿瘤区域温度。肿瘤区域温度从33℃迅速升高到56.5℃，并在3 min内达到最大值，这体现了TS NPs在体内良好的光热性能。相比之下，在对照组(PBS+Light)中，肿瘤区域的温度仅升高了5℃，说明激光本身并没有明显改变肿瘤的温度。随后，我们进一步评估了660nm激光对荷瘤小鼠肿瘤体积和体重的影响。以PBS(暗处理)作为对照，发现激光照射(1次，660 nm, 500 mW cm−2,5 min)后小鼠的肿瘤体积和体重几乎没有差异。
将4T1细胞注射到小鼠体内构建模型小鼠(第6天)。6天后(第0天)，当皮下肿瘤体积达到≈40 mm3时，经尾静脉注射不同药物，24 h后(第1天)进行激光照射(1次，660 nm, 500 mW cm−2,5 min)。将肿瘤大小相近的小鼠分为5组:(I) PBS + L组，(II)索拉非尼NPs组，(III) TS NPs + D组，(IV) DBD-TM NPs + L组(V) TS NPs + L组，每隔一天测量小鼠体重和肿瘤体积。观察到I-III组肿瘤体积逐渐增大。IV组肿瘤体积虽受到抑制，但在后期逐渐增大，出现肿瘤复发。与此形成鲜明对比的是，V组在治疗过程中肿瘤未复发，有力地证明了TS NPs可以实现肿瘤消除。此外，在整个治疗过程中，小鼠的体重基本保持不变，结果显示这些NPs的全身毒性可以忽略不计。第14天，V组肿瘤明显消失，而其他组(I-III组)肿瘤生长更明显或复发(IV组)。通过fitc标记的葡聚糖测量血管渗漏来研究肿瘤血管通透性。激光照射小鼠肿瘤区域5 min, 24 h后静脉注射fitc标记的葡聚糖，30 min后采集肿瘤。末端脱氧核苷酸转移酶dUTP缺口末端标记(TUNEL)和Ki67实验显示，V组肿瘤细胞凋亡大量，增殖最小，显示其有效杀伤能力。与PBS组比较，IV组和V组小鼠肿瘤切片右旋糖酐渗漏量明显增加，说明含DBD-TM纳米颗粒在激光照射下可破坏肿瘤血管，这是由DBD-TM的光热效应引起的。值得注意的是，血小板内皮细胞粘附分子-1 (CD31)检测显示，治疗组(V组)血管生成明显受到抑制。此外，对照组(II组和III组)也有明显的血管抑制，而I组和IV组有相对明显的血管生成。
总结
我们报道了一种基于精心定制的AIEgen和抗血管生成剂的多功能纳米材料，允许对癌症进行多模式成像导航协同治疗。通过对结构构象、D-A强度和分子内旋子的细微调控，构建了AIEgen DBD-TM，在单次660 nm激光照射下，表现出显著的NIR-II荧光信号和显著的光热转换行为，表现出辐射和非辐射激发态能量耗散的独特平衡。采用纳米沉淀法，将DBD-TM与抗血管生成剂索拉非尼结合制备TS NPs。TS NPs继承了DBD-TM和索拉非尼的固有特征，具有合适的纳米药物粒径、良好的单分散性和水相稳定性、良好的生物相容性以及良好的肿瘤靶向能力。体外和体内评估显示，TS NPs在NIR-II FLI-PAI-PTI三模态成像导航的ptt抗血管生成协同治疗中表现良好，同时提供准确的肿瘤诊断成像和完全的肿瘤消除。
参考文献
Regulating Aggregation-Induced Emission Luminogen for Multimodal Imaging-Navigated Synergistic Therapy Involving Anti-Angiogenesis Fei Zhang, Jie Cui, Yao Zhang, Miao Yan, Xiaoxiao Wu, Xue Liu, Dingyuan Yan, Zhijun Zhang, Ting Han, Hui Tan,* Dong Wang,* and Ben Zhong Tang*,Adv. Sci. 2024, 2302713,DOI: 10.1002/advs.202302713
