内容提要
我们开发了一种极性敏感的脂滴（LDs）靶向探针，用于脂质代谢动态的时空超分辨成像。基于受激发射损耗（STED）和荧光寿命成像显微镜（FLIM）平台，我们在原位病理模型中实现了脂滴非线性融合与扩张机制的超分辨可视化和动态追踪。我们还利用 STED-FLIM 平台分析了斑马鱼模型中的脂质分布，以捕捉机体水平的脂质代谢情况。基于集成的 STED-FLIM 平台，该探针能准确监测动脉粥样硬化和脂肪肝的细胞及病理组织环境中的脂质代谢。
本研究采用原子取代法合成了一种智能脂滴靶向探针 TPASe，用于 STED-FLIM 时空超分辨成像及脂质过氧化模型构建。在分子设计中，2,1,3 - 苯并噻唑单元中的硫原子被较重的硒（Se）原子取代，这通常会减小带隙，导致波长红移。这种修饰增强了该系统与 STED 成像中使用的各种损耗波长的兼容性，具体而言，它实现了荧光发射红移，以满足脉冲 STED 激光的损耗光（775 nm）的要求。另一方面，硒原子的引入和丙烯腈的加入增强了分子内电荷转移（ICT），形成了一种新型的 D-A-A 共轭体系，可精细调节活性氧水平，从而构建原位脂质过氧化模型。TPASe 具有强给电子三苯胺单元和受电子 2,1,3 - 苯并硒二唑核心，二者通过 Suzuki 偶联反应连接。TPASe 对环境极性具有显著的敏感性，非常适合在 STED-FLIM 平台上分析脂质代谢动态。与 TPAS 相比，TPASe 的吸收光谱红移 24 nm，发射光谱红移 50 nm。此外，TPASe 在非极性 1,4 - 二氧六环中表现出强荧光，发射峰位于 670 nm。在水介质中，随着溶剂极性的增加，发射峰红移至 729 nm；同时，其在 1,4 - 二氧六环中的量子产率是在水介质中的 39 倍以上。荧光发射光谱延伸至 850 nm，非常适合使用 775 nm 损耗激光的脉冲 STED 激光。对于 TPASe，随着溶剂极性的降低，观察到荧光寿命显著增加。低极性溶剂 1,4 - 二氧六环中的寿命为 3.43 ns，而高极性溶剂水中的寿命为 0.19 ns，这一现象清楚地证明了这一点。
共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）成像结合定量分析显示，TPASe 可在 30 分钟内被活细胞快速内化。使用商业脂滴染料 BODIPY 493/503 进一步验证了 TPASe 在活细胞中的靶向能力。TPASe 的明亮点状荧光信号（红色通道）与脂滴中 BODIPY 493/503 的荧光信号（绿色通道）完美重叠，皮尔逊共定位系数（PCC）为 0.95，证实了其脂滴靶向能力。TPASe 优异的光物理性质促使我们对脂滴超微结构进行超分辨 STED 成像。与传统 CLSM 相比，在 775 nm 损耗激光下，STED 模式实现了显著更清晰的亚衍射分辨率。为了更精确地比较，随机选择感兴趣区域（ROI）1 和 2 进行详细的成像分析。如 ROI 1 的放大图所示，在 STED 通道中脂滴显示出清晰的边界，而在 CLSM 通道中仅可见模糊的点。在 CLSM 和 STED 模式下计算的半峰全宽（FWHM）值显示，在 STED 模式下，FWHM 为 71 nm，比 CLSM 模式（约 191 nm）窄 2.7 倍。此外，图 2d 中的两个相邻脂滴在 STED 模式下被清晰区分，FWHM 值分别为 56.5 nm 和 63 nm。相比之下，CLSM 模式显示出一个模糊的脂滴团，FWHM 值为 194 nm。通过在 775 nm 处获取不同损耗功率下的图像，我们进一步计算了细胞中 TPASe 的饱和激光功率（Pₛₐₜ）和损耗效率。随着 775 nm STED 激光功率的增加，脂滴图像变得越来越清晰，脂滴荧光强度的半峰全宽不断减小，直至达到最小值。低至 2.03 mW 的饱和激光功率就足以达到 50% 的荧光强度，这凸显了低光功率在实现高分辨率脂滴成像方面的潜力。如图 S17 所证实，相对较小的荧光发射位移几乎不影响 STED 效率的显著变化。之后，将 TPASe 的光稳定性与商业脂滴探针尼罗红和 BODIPY 493/503 进行了比较。标记 A549 细胞后，尼罗红和 BODIPY 493/503 的荧光在 50 帧后逐渐消失，而 TPASe 在第 100 帧时仍保持强荧光信号。TPASe 优异的光稳定性可能是由于丙烯腈中存在吸电子基团，这显著降低了 HOMO-LUMO 能级，并有效保护了 C=C 双键。这种出色的光稳定性确保了对活细胞中脂滴的可靠长期追踪和动态分析。
借助 STED 超分辨技术以及 TPASe 优异的理化性质和生物相容性，我们能够更精准地量化各种病理条件下脂滴（LDs）的数量和大小分布，例如油酸（OA）诱导的脂质代谢异常和汉克平衡盐溶液（HBSS）诱导的脂噬。STED 模式可以清晰区分两个距离很近的小脂滴。具体而言，在图 S18 所示的 STED 图像中，脂滴直径从平均 800 nm 显著减小至 200 nm，是 CLSM 观察到的大小的一半。相应地，可检测到的脂滴数量从约 150 个显著增加到约 600 个。与 CLSM 模式相比，STED 模式提供的脂滴分辨率显著提高，脂滴尺寸更小且数量更多，这体现了超分辨成像在准确测定脂滴数量和大小方面的优势。
过氧化脂质物质的过载是多种疾病（包括动脉粥样硬化和败血症）发生发展的重要因素。为了实时模拟脂质过氧化，我们利用了 TPASe 在光照条件下产生活性氧（ROS）的能力。首先，在溶液和活细胞中评估了 TPASe 的活性氧产生水平。使用商业活性氧探针 2'，7'- 二氯二氢荧光素二乙酸酯（DCFH-DA）作为指示剂，与商业光敏剂二氢卟吩 e6（Ce6）和玫瑰红（RB）相比，TPASe 表现出更强的活性氧产生能力。在活细胞中，高功率光照和低功率光照下的 H₂O₂刺激均显著增加了活性氧水平。相反，低光功率和活性氧清除剂尿酸（UA）的存在不会激活细胞内活性氧探针的荧光。这些结果证实，通过调节光照强度和引入活性氧清除剂，可以可控地建立细胞内活性氧模型。随后，采用高剂量光照刺激脂滴原位产生大量活性氧，从而能够动态追踪脂质过氧化过程中的脂滴行为。随着照射时间的增加，脂滴逐渐增大并呈现细胞质均一化。此外，随着小的独立脂滴逐渐肿胀，伴随肿胀的脂滴相互作用，导致一些独立的脂滴融合成更大的脂滴，并进一步发生非线性肿胀。STED 成像详细捕捉到了这些脂滴融合事件。
在低功率光照下 H₂O₂刺激时也观察到了这种现象。相比之下，商业探针 BODIPY 493/503 的高剂量光刺激以及添加活性氧清除剂的 TPASe 低剂量光刺激均未能诱导脂质过氧化。。低密度脂蛋白（LDL）可被活性氧氧化形成氧化型低密度脂蛋白（ox-LDL），这在对抗细胞脂质过氧化中起着至关重要的作用。巨噬细胞通过 CD36 等清道夫受体内化氧化型低密度脂蛋白，以减轻氧化应激并维持 redox 稳态。然而，当氧化型低密度脂蛋白的摄取超过细胞的处理能力时，巨噬细胞会转化为富含大量氧化脂滴的泡沫细胞。在此过程中，CD36 的表达显著上调。这些泡沫细胞在血管内皮下层积聚，促进动脉粥样硬化斑块的形成。准确且详细地记录巨噬细胞中的脂质动态对于理解动脉粥样硬化的进展至关重要。在本研究中，我们使用氧化型低密度脂蛋白孵育巨噬细胞，建立了动脉粥样硬化早期病变的细胞模型。CD36 表达的蛋白质印迹实验与氧化型低密度脂蛋白剂量（0-80 μg・mL⁻¹）和孵育时间（0-24 h）的上升轨迹一致，从而证实了巨噬细胞来源的泡沫细胞模型的成功建立。与商业 BODIPY 493/503 相比，TPASe 的强荧光结合 STED 成像使我们能够在该模型中更清晰地可视化脂滴的产生、融合和聚集过程。
利用 TPASe 对环境极性显著的荧光和荧光寿命响应及其在 STED 成像中的优异表现，我们还将 TPASe 应用于 STED-FLIM 成像中。在 CLSM 和 STED 模式下均评估了荧光寿命成像的分辨率。TPASe 在 STED 模式下表现出更高分辨率的荧光寿命成像，实现了 84.6 nm 的最小半峰全宽值，显著小于 CLSM 模式下的 262 nm。此外，STED-FLIM 平台使我们能够清晰区分和分析单个脂滴内的极性分布。图中的放大图展示了以任意半径为参考，从单个大脂滴的外围到中心逐点收集的荧光寿命数据。结果显示，荧光寿命值从脂滴的外边缘到中心逐渐增加。例如，脂滴边缘的荧光寿命约为 406 ps，在脂滴中心显著增加到 1615 ps。脂滴被单层磷脂包裹，内部充满中性脂质，液滴内物质的不均匀分布会导致极性变化。鉴于 TPASe 的极性敏感性与其荧光寿命密切相关，这使得能够对单个脂滴内的极性进行精确的超分辨荧光寿命追踪。
在体内模型中，FLIM 成像应用于 24 小时龄的斑马鱼，以研究脂质分布和组成。在斑马鱼的不同区域观察到显著的荧光寿命差异。随后，从三个不同区域收集了荧光强度和寿命分布：血管（标记 1）、腹部（标记 2）和颈部肌肉组织。结果表明，同一解剖区域的荧光强度和寿命均存在统计学显著差异。总体而言，腹部肝脏和未吸收的卵黄区域（标记 2）表现出更高的脂质含量，对应更长的荧光寿命值10。相比之下，颈部肌肉组织（标记 3）尽管有较亮的蓝色信号，但由于脂质储备稀少，对应着短得多的荧光寿命。例如，在标记 iv 的区域，相图分为三个簇，每个簇代表不同的荧光寿命分布。寿命主要分布在三个范围内：寿命 1、寿命 2 和寿命 3，从 30 到 3000 ps 不等，对应于图 5c（iv）中的荧光寿命分布。在 1000 ps 以下，荧光寿命主要出现在口腔和鳃区域，如相图的选择性聚类所示。在 1000 到 2000 ps 之间，胃和口腔区域表现出强荧光强度，寿命范围为 30 到 1500 ps，表明这些区域的脂质体极性相对较高。此外，脑血供、鳃和心脏区域表现出更长的寿命，范围为 1500 到 2800 ps，这可能是由于脑血供中的氧合、鳃中的呼吸以及心脏中心跳的维持需要大量脂质来提供能量。作为呼吸器官的一部分鳃，极性较低，具有强荧光强度和约 400-800 ps 的短荧光寿命。TPASe 利用 FLIM 成像提供了斑马鱼胚胎中脂质分布的精确图谱。由于卵黄囊在胚胎发育过程中提供能量和结构脂质，在该区域观察到的强荧光强度和长荧光寿命证实了低极性脂质的丰富存在。FLIM 成像提供的斑马鱼血管、腹部和颈部肌肉组织中的极性分布与先前报道的健康组织中的值一致。这些发现强调了 TPASe 在体内追踪脂质代谢和实时监测 redox 微环境变化方面的实用性。
总结
我们研发了一种靶向脂滴（LDs）的探针 TPASe，通过结构优化使其具有 D-A-A 共轭结构，旨在对生理/病理条件下脂质代谢动态进行时空超分辨成像。TPASe 对环境极性具有显著的敏感性，其荧光强度和寿命会发生明显变化。这些特性使 TPASe 成为活细胞中脂滴动态成像的理想选择。借助受激发射损耗（STED）超分辨显微镜，我们实现了脂滴超微结构和细胞器相互作用的精确可视化。通过产生活性氧（ROS）构建原位脂质过氧化模型，我们利用 STED 成像追踪了脂滴的融合与扩张过程，为研究脂质代谢及相关疾病开辟了新的认知视角。将 STED-FLIM 成像与 TPASe 相结合，能够在体外和体内对单个脂滴内的极性分布进行全面分析，凸显了其在脂质代谢研究中的潜力。
参考文献
Spatiotemporal Super-Resolution Imaging of Lipid Metabolism Dynamics in Physiological/Pathological Conditions，Shixian Cao+, Qihang Ding+, Caixia Sun, Borbala Codogno, Zhiqiang Liu, Xiaoqiang Yu,* Jong Seung Kim,* and Kang-Nan Wang*,Angew. Chem. Int. Ed. 2025, 64, e202502159， doi.org/10.1002/anie.202502159
