内容提要
热休克蛋白 40（HSP40）可通过抑制糖酵解和破坏线粒体功能来克服肿瘤自我防御机制，并发挥抑瘤作用。I 型光动力疗法产生的活性氧（ROS），尤其是羟基自由基，会抑制三磷酸腺苷（ATP）的生成，并在热应激条件下导致不依赖 ATP 的 HSP40 过表达。阐明热应激条件下HSP40 表达诱导的潜在机制，作为肿瘤治疗新策略的潜力至关重要。通过对氮杂BODIPY结构进行策略性修饰以精确分配激发态能量，证实 HSP40 的特异性表达与热和羟基自由基的比例相关，而非两者各自的水平。基于近红外二区（NIR-II）光敏剂的纳米颗粒可降低肿瘤糖酵解水平、破坏 ATP 生成，从而诱导细胞凋亡并增强光热疗法的疗效。
新型氮杂 - BODIPY 基近红外二区光敏剂的设计与表征
具有供体 - 受体 - 供体（D-A-D）结构的氮杂-BODIPY（aza-BODIPY）在近红外二区窗口内具有优异的光热性能。增强供电子能力可促进该特定氮杂 - BODIPY 分子内的电荷转移，导致吸收光谱红移。这一变化有效缩小了不同能级之间的带隙，促进系间窜越（ISC）的发生。我们通过在 NJ1060 的 2,6 位引入不同供电子基团 —— 苯（FB1）、甲苯（FB2）、呋喃（FB3）和噻吩（FB4），以改变其系间窜越能力。此外，我们还利用长链（噻吩长链，FB5）的空间效应来抑制分子内运动、增强平面性，从而提高量子产率。同时，分子刚性的增强还同步提升了消光系数和光热性能。通过氧原子与硼原子形成螯合作用，可产生更大且更刚性的平面结构。FB 系列分子在 500-1000 nm 范围内呈现三个明显的吸收峰。由于 B-O 螯合作用增强了结构刚性和电子迁移率，OB 系列分子的第二和第三个吸收峰在 700-900 nm 范围内部分重叠，因此实验中仅观察到两个可分辨的峰。
我们采用 DSPE-PEG₅₀₀₀将光敏剂包封成纳米颗粒（NPs），这对于推动其生物应用至关重要 。通过透射电子显微镜（TEM）表征纳米颗粒的形貌，并使用 Zetasizer Nano ZS 测量其在液体悬浮液中的尺寸和 zeta 电位。TEM 图像显示，FBs@NPs 和 OBs@NPs 均呈均一形态，尺寸约为 100 nm，与动态光散射（DLS）结果一致。Zeta 电位值在 - 15 至 - 25 mV 之间，有利于纳米颗粒在血液中的转运。此外，我们还评估了 DSPE-PEG₅₀₀₀作为光敏剂纳米载体的包封效率（EE）和载药量（DLC）。FBs 和 OBs 的包封效率均超过 80%，载药量在 7%-9% 之间。我们对纳米颗粒的光物理性质进行了全面研究，发现它们在 550-1000 nm 范围内仍保持宽吸收谱带，即使在较长波长（808 nm）下也具有显著的光吸收能力（左侧实线），使其适用于深层组织治疗。此外，这些纳米颗粒在 808 nm 激发波长下，最大发射峰均稳定在约 1000 nm 处（右侧虚线）。我们测定了纳米颗粒在不同吸收波长下的 ε 值，以此作为评估其光学亮度和光热性能的依据。结果发现，OB5@NPs 的 ε 值最高，FB5@NPs 次之，这表明增强分子侧链的供电子能力和提高分子刚性可增强该结构的摩尔消光系数。为验证纳米颗粒的光稳定性，我们将其在水溶液中进行长时间照射（100 min）。结果显示，照射后 FBs@NPs 和 OBs@NPs 的光稳定性优于 IR1061。随后，我们通过监测 808 nm 激光照射下的温度变化来评估纳米颗粒的光热性能。纳米颗粒的温度升高与纳米颗粒浓度和激光功率密度均呈正相关，表现出依赖性关系。基于这些发现，我们将测试条件固定为光敏剂浓度 0.3 mg/mL、激光功率密度 0.2 W/cm²。光热转换效率（PCE）是评估光敏剂光热性能的关键指标，反映其将光能转化为热能的能力。在 808 nm 激光（0.2 W/cm²）照射下，FBs@NPs 和 OBs@NPs 均表现出优异的光热性能（效率 38%-48%）。
活性氧生成效率研究
我们选择 FB5@NPs 和 OB5@NPs 进行进一步的活性氧生成效率研究。我们使用 2,7 - 二氯荧光素二乙酸酯（DCFH-DA）作为总活性氧生成的指示剂，在 OB5@NPs 存在下，经激光（808 nm，0.8 W/cm²）照射 10 min 后，DCFH 的荧光强度逐渐增加，增强倍数达 59.2 倍；相比之下，FB5@NPs 组的 DCFH 强度增长较慢，仅增强 16.1 倍。由于缺乏近红外二区窗口内用于生成・OH 的参考光敏剂，本研究采用 DCFH 作为活性氧捕获剂，并以已知可生成 ¹O₂的 ICG（0.20%）作为参考。测定结果显示，FB5@NPs 和 OB5@NPs 在水中的总活性氧生成率分别为 0.10% 和 0.15%。我们分别选择单线态氧荧光探针（SOSG）和超氧阴离子探针（DHR123）验证 FB5@NPs 和 OB5@NPs 的活性氧生成情况。在相同激光条件下，FB5@NPs+SOSG 和 OB5@NPs+SOSG 组的荧光强度未显著增加，表明两种纳米颗粒生成 ¹O₂的能力有限；而在 FB5@NPs 和 OB5@NPs 存在下，照射后 DHR123 的荧光强度分别增加 9.9 倍和 25.3 倍，表明两者可显著生成 O₂・⁻。为进一步证实上述观察结果，我们使用 5,5 - 二甲基 - 1 - 吡咯啉 - N - 氧化物（DMPO）和 2,2,6,6 - 四甲基 - 4 - 哌啶酮盐酸盐（TEMP）作为自旋捕获剂进行电子自旋共振（ESR）测量。结果显示，FB5@NPs 和 OB5@NPs 经激光（808 nm，0.8 W/cm²）照射 8 min 后出现 ESR 信号，表明生成了・OH，而・OH 可在生理条件下由 O₂・⁻转化产生。
FB5@NPs 与 OB5@NPs 的光热稳定性及细胞光毒性评估
鉴于 FB5@NPs 和 OB5@NPs 优异的光物理性质，我们进一步对其在生物应用中的表现及与 HSP40 的关联展开了全面研究。我们对这些纳米颗粒的稳定性进行了严格评估。经过 5 次加热 - 冷却循环后，FB5@NPs 和 OB5@NPs 的温度输出变化可忽略不计，表明其具有优异的光热稳定性。此外，我们还在 14 天内评估了纳米颗粒在多种介质中的化学稳定性，未观察到其粒径或聚集状态发生显著变化，证实这些纳米颗粒适用于体外生物实验。而且，采用 DSPE-PEG₅₀₀₀进行包封不仅显著提升了光敏剂的水溶性和生物相容性，还提高了其细胞摄取效率。FB5@NPs 和 OB5@NPs 在 HeLa 细胞中的纳米内化率分别为 17.6% 和 21.7%。随后，我们利用内吞抑制剂研究了 OB5@NPs 的细胞进入机制：经氯丙嗪（10 μg/mL，作用 1 小时）处理后，细胞内荧光强度显著降低，表明氯丙嗪可有效抑制 OB5@NPs 的细胞摄取，这一结果进一步证实 OB5@NPs 通过网格蛋白介导的内吞作用进入细胞。基于 FB5@NPs 和 OB5@NPs 在产热与活性氧比例上的差异，我们研究了它们在体外对肿瘤细胞的杀伤能力。通过 PrestoBlue 细胞活力实验，在有无激光照射（808 nm，0.3 W/cm²，7 分钟）的条件下，对 HeLa 细胞（人宫颈癌细胞）和 HepG2 细胞（人肝癌细胞）进行了细胞毒性评估。结果显示，在无激光照射时，当纳米颗粒浓度为 30 μg/mL 时，所有细胞类型的存活率均稳定在 90% 以上，证实 FB5@NPs 和 OB5@NPs 均具有良好的生物相容性；而在激光照射下，细胞存活率急剧下降至 20%-30%，表明激光条件下产生的热效应和活性氧具有强烈的细胞毒性。为研究 FB5@NPs 和 OB5@NPs 的光疗效果，我们对 HeLa 细胞进行了如下处理：NPs（30 μg/mL）+ 激光（808 nm，0.3 W/cm²，7 分钟）、单独 NPs（30 μg/mL）或 PBS + 激光。采用钙黄绿素 AM（AM，活细胞呈绿色荧光）和溴化乙锭二聚体 - 1（EthD-1，死细胞呈红色荧光）对细胞进行活死染色。结果显示，经激光照射后，FB5@NPs 和 OB5@NPs 可诱导 HeLa 细胞完全破坏（EthD-1 染色阳性）；而单独激光组和单独 NPs 组仅观察到绿色荧光，表明 NPs 或激光单独作用时无细胞毒性。流式细胞术进一步证实了纳米颗粒的良好光热效应：激光照射后，坏死细胞比例从 1.18%（PBS + 激光组）增至 33.94%-35.57%，进一步证实纳米颗粒对 HeLa 细胞具有优异的光诱导细胞毒性。此外，FB5@NPs 组、OB5@NPs 组和 PBS + 激光组的活细胞比例均较高（分别为 91.25%、90.12% 和 95.07%），表明纳米颗粒的暗毒性可忽略不计。光敏剂经激光照射产生的热和活性氧还会进一步影响肿瘤细胞的线粒体功能和细胞周期：激光照射后，线粒体膜电位显著降低，导致线粒体损伤；细胞周期分析显示，G0/G1 期细胞比例显著下降，G2/M 期细胞比例相应增加，这与先前报道的结果一致。
FB5@NPs 与 OB5@NPs 在荷皮下肿瘤小鼠模型中的体内光疗效果
为进一步研究 FB5@NPs 和 OB5@NPs 的体内疗效，我们建立了 HeLa 荷皮下肿瘤小鼠模型，以研究纳米颗粒在肿瘤部位的动态聚集情况。向小鼠静脉注射纳米颗粒后，肿瘤部位的荧光强度在 48 小时后逐渐增至最大值，表明增强渗透滞留（EPR）效应带来的滞留作用。药代动力学分析显示，OB5@NPs 在小鼠体内的半衰期比 FB5@NPs 更长，这可能归因于两者在尺寸和电荷上的差异，这种特性延长了其在血液中的循环时间，增强了在肿瘤部位的聚集。生物分布研究表明，FB5@NPs 和 OB5@NPs 主要富集在网状内皮系统，并通过肝胆代谢排出体外。体内光热成像（PTI）显示，经 8 分钟激光照射（808 nm，0.8 W/cm²）后，FB5@NPs 和 OB5@NPs 组的最高温度分别达到 44.2℃和 48.7℃，表明两种纳米颗粒均具有有效的光热治疗潜力。利用活性氧探针研究肿瘤组织中的活性氧类型，结果显示纳米颗粒可光诱导产生超氧阴离子，这与电子顺磁共振（ESR）数据一致。随后，我们在静脉注射纳米颗粒 48 小时后，每隔一天对荷 HeLa 肿瘤裸鼠进行光疗。结果显示，FB5@NPs 和 OB5@NPs 均能显著抑制肿瘤生长，其中 OB5@NPs + 激光组的疗效最为显著，这可能归因于其可精确诱导热和活性氧的产生，从而辅助光热治疗。肿瘤切片的苏木精 - 伊红（H&E）染色显示，经激光照射后，纳米颗粒对肿瘤组织造成了显著损伤，而对其他内脏器官无显著影响。肿瘤组织的 TUNEL 染色还显示，OB5@NPs 照射组的凋亡细胞数量显著多于其他组，表明纳米颗粒具有优异的光疗能力 —— 单次给药经激光照射后即可安全有效发挥作用，且不会对其他组织造成额外损伤（808 nm，0.8 W/cm²）。光疗 14 天后，小鼠体重未发生显著变化，表明其术后恢复情况良好。
结论
本研究在设计 FBs 和 OBs 光敏剂时，综合考虑了供体 - 受体 - 供体（D-A-D）相互作用、分子刚性及共平面性等影响摩尔消光系数的因素，成功实现了对激态分子能量分配的调控。首先，2,6 位的强供电子基团使光敏剂能够产生近红外二区荧光发射，便于研究其在体内的分布及生物安全性；其次，烷基修饰增强了 OB5@NPs 的光热性能，可实现低剂量肿瘤光热疗法；第三，与 FB5@NPs 相比，OB5@NPs 结构的刚性和共平面性使其具有更大的电子云、更小的单重态 - 三重态能级差（ΔEst）及更强的系间窜越（ISC）能力，从而能够产生足量活性氧（ROS）以满足光动力疗法的需求。
参考文献
NIR-II Photosensitizer-Based Nanoparticles Defunctionalizing Mitochondria to Overcome Tumor Self-Defense by Promoting Heat Shock Protein 40.Panpan Li,Jiaxin Zhang,Tao Shao,∥Jiamin Jiang, Xiao Tang, Jiaqi Yang, Jintao Li, Bin Fang, Ze Huang, Haixiao Fang, Hui Wang, Wenbo Hu, Bo Peng,* Hua Bai,* and Lin Li*. ACS Nano 2025, 19, 15751. https://doi.org/10.1021/acsnano.4c18937
