内容提要
将探针与先进的成像技术相结合，实现了基于单器定位的超分辨率成像，彻底改变了我们以前所未有的精度研究亚细胞分子的能力。本文综述了小分子探针的设计和应用，以及超分辨率成像技术的进展。综述了超分辨率成像技术的工作原理、技术进展和独特的优点。我们还概述了创新的探针设计策略，可以增强我们对亚细胞分子动力学及其单细胞器定位的理解。本文还提供了针对不同细胞器内分子的探针设计策略，强调需要考虑光稳定性、信噪比和靶向结合等因素。本文还详细讨论了与该领域相关的挑战、潜在的解决方案和前景。通过将探针设计与基于单细胞器定位的最先进成像技术相结合，本综述为在最复杂的分子相互作用水平上揭示单细胞器功能提供了一条途径。
用于超分辨荧光成像的小分子探针设计
大多数超分辨率小分子探针都含有一个大的共轭结构，作为一个荧光团，与特定的结合基团连接，与特定的亚细胞分子或细胞器靶向基团发生反应，在特定的细胞器内积累，他们的最终任务是在细胞或动物中提供一种反映某种生物过程变化的光信号。为了制造一种光学性能稳定、响应速度快、抗干扰能力强的理想探针，以获得高质量的成像，应考虑以下五个设计原则:(1)小分子探针在超分辨率成像中应具有高量子产率;(2)长期动态成像需要稳定的光学性能;(3)为了获得高信噪比，应考虑窄谱特性和大Stokes位移;(4)与亚细胞分子反应时应包含特定的结合基团;(5)还应包含细胞器靶向基团，以确保在特定细胞器内富集。设计满足上述要素的探针可以缩短迭代试错过程。因此，根据上述要素构建了许多小分子探针，用于单色/双色/多色成像，靶向特定细胞器，同时识别多个亚细胞分子。这些探针已应用于细胞成像，并揭示了许多生物过程，包括铁下垂。为了更好地理解探针的设计原理，我们总结了最近报道的探针，重点关注它们的荧光团、结合基团和细胞器靶向基团。在上述设计准则中，荧光团主要对应前三项，结合基团主要对应第四项，细胞器靶向基团主要对应第五项。大多数探针由荧光团、结合基团和细胞器靶向基团组成，它们通过烷基链连接(如MitoBo)，或者两个或三个可以形成共轭体系(如qvc - b和Coupa)。因此，在设计用于超分辨率成像的最佳探头时，有必要考虑这些方面。
常见的荧光团
荧光团是在紫外-可见-近红外区域具有荧光特性的化学有机分子。对荧光探针进行结构修饰后，其荧光特性很容易通过环境变化而改变。荧光探针具有检测亚细胞分子快速、灵敏、简便等特点，作为信号分子广泛应用于环境监测、食品质量检测、基础研究、临床治疗等领域，报道环境的细微变化。通常，荧光探针的激发/发射波长主要受其共轭体系的影响，共轭体系越长，荧光激发/发射波长越长。由于短波长对细胞的有害影响，长波长(650-900 nm)荧光团是研究人员构建新型探针的首选工具。常见的荧光团(a-z)，如香豆素(j)，半花青素(c)，喹啉(g)，咔唑(p)，萘酰亚胺(r)和三苯胺，是由苯环和其他杂原子五元/六元环合并而成的共轭体系。然而，合并两个或三个环的共轭系统提供的波长是有限的。为了获得波长更长的荧光团，可以将多个环合并形成共轭体系，如BODIPY (t)和罗丹明(x)。此外，一些超大共轭体系也通过荧光团组装得到近红外探针，如香豆素-半花青素和香豆素-咔唑共轭体系。
Yang等使用环己四烯共轭菁菁染料(PK Mito染料)靶向线粒体，显示出较低的光毒性。不同的C=C键数会产生不同的荧光发射波长，如cc1的激发/发射波长为549/569 nm (n = 1)， cc2的激发/发射波长为644/670 nm (n = 2)。该策略通过使用不同数量的C=C键共轭两个半花青碱基团，产生不同的荧光发射波长。cc显示了使用相同方法构建荧光团。Chen等人利用C=C键将半胱氨酸和香豆素基团偶联，如cj。除香豆素基团外，半菁氨酸常用于偶联其他荧光团，如cl、cr和cx。Wang等报道了一种基于三苯胺的荧光探针，用于靶向线粒体脂质和线粒体DNA (mtDNA)。三苯胺(s)通过C=C键与喹啉(g)偶联后，探针的最大发射波长(gs)从600 nm红移至700 nm。Zhou等人报道了一种基于罗丹明和萘酰亚胺的靶向溶酶体探针(rx)。由于罗丹明和萘酰亚胺之间没有形成共轭体系，所以rx的发射波长没有发生明显的红移(515 nm和595 nm)。Wu等人也报道了罗丹明与萘酰亚胺基团通过烷基链偶联的探针(rx1)，其发射波长与rx接近。Liu等人报道了一种基于罗丹明和半菁氨酸的探针(cx)，该探针形成了一个包含C=C键的大共轭体系，其发射最大值在739 nm处显示出显著的红移。Wang等人报道了一种近红外荧光探针(gl)，使用C=C键共轭两个荧光团，对过氧化氢(H2O2)具有高灵敏度，在772 nm处增强了10倍。因为它们是探针的主要结构，所以荧光团结构影响探针的激发/发射波长。具有小共轭系统的荧光团需要紫外线激发，这可能导致细胞损伤并会受到细胞自身荧光的影响。因此，较大的共轭体系是理想的荧光团。
亚细胞分子的结合基团
结合基团作为探针的重要组成部分，起到“按钮”的作用，通过特异性结合亚细胞分子激活，产生显著的荧光响应。为了设计理想的荧光探针，结合基团必须具有合理的结构。因此，有必要对不同的结合基团进行分类和总结，以了解它们在设计探针时的适用性和局限性。结合特异性不足的结合基团有很多种，包括离子的螯合剂基团、ROS的硼酸酯基团、RSS的C=C键基团等。这些结合基团已被证实可以选择性地与特定类型的亚细胞分子结合，并为探针提供了关键的识别功能。结合基团与亚细胞分子的结合响应时间和灵敏度与探针结构密切相关。
螯合基团
识别离子的最简单策略之一是将离子螯合剂结合基团连接到荧光团上。在众多离子中，Zn2+可以与多种螯合剂结合，包括二聚胺(DPA)、N,N,N '，N ' -四(2-吡啶基甲基)-乙二胺(TPEN)、N,N ' -二(吡啶-2-甲基)乙烷-1,2-二胺(BPEA)、N,N,N ' -三(吡啶-2-基甲基)乙烷-1,2-二胺(TPEA)和乙二腈四乙酸(EDTA)。因此，将这些螯合剂连接到荧光团上可以使它们结合Zn2+。Liu等报道了几种同时监测多个细胞器中Zn2+的探针(ZnDA- 1H、ZnDA- 2h和ZnDA- 3h)。这些探针将DPA连接为氨基香豆素荧光团上的Zn2+结合基团，并结合HaloTag同时监测细胞质、细胞核、内质网和线粒体中的Zn2+。此外，Du等人报道了几种溶酶体靶向探针(DPP-C2、LysoDPP-C2、LysoDPP-C3和LysoDPP-C4)，它们利用基于甲氧基的N,N-二-(2-吡啶)乙二胺(MeO-DPEN)结合来识别Zn2+。这些Zn2+结合基团通过光诱导的电子转移实现荧光响应，从而在溶酶体中成像Zn2+。同样，Fang等人报道了连接BPEA或TPEA作为Zn2+结合基团的不同探针
硼酸酯和硼酸基团
一些易氧化基团通常被用作ROS的结合基团，包括硼酸酯和硼酸。H2O2是一种强氧化性ROS，可以氧化硼酸酯或硼酸，产生新的电子分布，产生荧光响应。因此，Xu等人报道了一种开启荧光探针(Mito-H2O2)，利用硼酸酯作为H2O2的结合基团，用于检测活细胞中线粒体H2O2。H2O2与硼酸酯反应，将其从荧光团中移除，改变探针的电子分布，导致对H2O2的荧光响应。同样，Yang等人设计了硼酸酯作为H2O2的结合基团。硼酸也被证明对H2O2敏感，Wu等和Liu等报道了基于该结合基团的探针。
双键基团
作为另一种容易氧化的基团，双键如C=C或C=N键也可以用来结合ROS、RNS和RSS。与ROS和RNS结合时，双键容易氧化而完全断裂，与RSS结合时，双键发生加成反应而不完全断裂。Lan和Nie等人报道了一种具有次氯酸(ClO-)双键结合基团的探针，它也作为C=C键作为连接两个荧光团的π桥。作为一种RNS，过氧亚硝酸盐(ONOO-)是一种氧化剂，对C=C键、C=N键、硼酸酯和罗丹明B等还原性基团高度敏感。因此，这些还原性基团通常与荧光团连接以结合ONOO-。C=C或C=N键通过一步加成反应将两个荧光团连接成荧光探针，这提供了一种简单的合成策略。有许多基于此策略的探针可以为ONOO-提供荧光响应。郭等人报道的萘酰亚胺-半苯胺基探针(Lyso-NA)，孙等人报道的三苯胺-苯并噻唑基探针(TP-1Bz)， Lu等人报道的罗达明支架基探针(比率- a)， Shen等人报道的2-(2 ' -羟基苯基)苯并恶唑基探针(BTP)利用C=C或C=N键来感应ONOO-。
除了用于结合氧化性ClO-或ONOO-外，C=C键还可以作为RSS的结合基团，例如亚硫酸氢盐(HSO3-)和谷胱甘肽(GSH)。Ma等人[88]报道的基于香豆素-氰吡啶的探针(1)，Chen等人报道的基于香豆素-半花青素的探针(CouMC)，以及Liu等人报道的基于香豆素-咔唑的探针(CZId)，它们利用C=C键作为HSO3-的结合基团。HSO3-和C=C键之间的加成反应导致探针内的电子重新分布。当C=C键被用作HSO3-、ClO-或ONOO的结合基团时，它们都产生了比色和辐射荧光响应。不同之处在于HSO3-和C=C的结合并没有完全切割C=C键。C=C键也被报道为谷胱甘肽的结合基团，包括Khatun等人报道的基于香豆素-吡啶的探针(GScp)[和Hou等人报道的基于香豆素的探针(QG-S)。
N, N-dimethylthiocarbamate基团
N,N-二甲基硫代氨基甲酸酯(DMTC)是ClO-常用的结合基团，它通过醚键连接到荧光团，其中ClO-破坏醚键并从荧光团中去除DMTC。由于官能团的破坏，探针的电子经历重排。因此，这些荧光探针在朝向ClO时通常表现出比色和比例荧光响应。他等人报告了一个使用DMTC作为ClO绑定组的探针(CX-MTC)-。当DMTC被ClO氧化时，探针显示出分子内电荷转移机制，从而导致显著的荧光变化。在DMTC被ClO去除后，探针发生了140 nm的大发射位移和63倍的荧光强度比增强，表现出比色和比变化。同样，Fang等人利用DMTC组构建了用于ClO-识别的荧光探针(HD-Br-1)。
细胞器靶向
细胞器存在于细胞质中，具有特定的形态结构和生理功能。例如，杆状线粒体负责有氧呼吸，圆形溶酶体负责消化功能，网状内质网负责蛋白质和脂质合成。细胞器微环境有相当大的差异。例如，溶酶体是酸性的(pH为4.5-6.0)，但线粒体是弱碱性的(pH为8.0)，线粒体跨膜电位约为180 mV。因此，这些细胞器执行不同的功能，如能量代谢、蛋白质合成和有氧呼吸。实时跟踪这些细胞器的生理活动变化，有助于了解细胞器功能变化与疾病发生的关系。因此，根据细胞器微环境的特点，设计了针对特定细胞器的荧光工具。据报道，荧光探针可以靶向的细胞器包括线粒体、溶酶体、脂滴、细胞核和内质网。为了提高靶向特定细胞器的探针的准确性，我们总结了靶向细胞器的探针的以下关键结构组。
靶向线粒体的正电荷基基团
电子显微镜显示，线粒体具有存在于细胞中的各种大小的球形、棒状或丝状颗粒。它们是参与调节能量生成、蛋白质合成、钙循环以及其他产生大量RNS和ROS的生化过程的细胞器。线粒体结构主要由线粒体外膜/内膜、线粒体膜间隙、线粒体基质、嵴、mtDNA组成。外膜与质膜相似，由蛋白质和磷脂(1:1)组成，主要作为细胞器边界膜。线粒体内膜由蛋白质和磷脂组成(3:1)，形成较大的线粒体跨膜电位进行生化反应。受这一特性的启发，许多带正电的基团被开发出来靶向线粒体，如半菁氨酸、苯并噻唑、喹啉、三苯膦(TPP)、罗丹明和吡。报道了一系列荧光半花青碱探针，它们通过半花青碱结构的n -正离子靶向线粒体，线粒体探针如图。由于线粒体具有优异的靶向和成像效果，一些基于半花青素的线粒体探针已经商业化，如Coupa。此外，Chen等利用TPP靶向线粒体的功能构建MitoISCH，用于跟踪mtDNA。除了线粒体靶向基团的构建外，一些天然化合物具有固有的线粒体靶向结构，如木兰花碱(magnnoflorine, MF)和小檗碱(berberine, BBR)。
溶酶体靶向
溶酶体是一种消化细胞器，被单层膜包裹，膜厚7 ~ 10 nm，直径0.025 ~ 0.8 μm，呈圆形或卵形。溶酶体微环境是酸性的，含有许多水解酶，可以分解亚细胞分子，如碳水化合物、核酸和蛋白质。溶酶体主要在各种生物过程中发挥消化作用，包括将外源食物消化成生物大分子和细胞分化过程中的老化细胞器。这些过程为机体自身组织更新提供必需的原料，并参与细胞凋亡、死亡、防御等多种生命活动。因此，利用溶酶体中亲脂胺转化为质子化胺的溶酶体微环境，设计了带有亲脂胺的溶酶体探针。这改变了探针的亲脂性，阻止其穿透溶酶体膜，因此它在溶酶体中积累，如图所示的溶酶体探针。在已报道的溶酶体探针中，4-(2-羟乙基)morpholine和N、n二甲胺/N、N-二乙胺是最常用的溶酶体靶群。例如，Tang和Mu等人报道了含有4-(2-羟乙基)啉的溶酶体探针(Na-FA-Lyso和Lyso-NPN3)。Xu和Wu等报道了N, n二甲胺溶酶体探针(Lyso-pH[110]和Lyso-HS)。
脂滴靶向
脂滴被细胞生物学家认为是惰性脂肪，但它们是普遍存在的具有独特结构成分的细胞器。例如，脂滴可以包裹在磷脂单层中，并嵌入各种蛋白质，它们在形成，生长，收缩，运动，与其他细胞器通信以及交换亚细胞分子中发挥重要作用。脂滴是由磷脂分子和相关蛋白组成的颗粒状细胞器，将中性脂肪包裹在一个单一的分子膜中。它们具有不同的尺寸，直径从20 nm到100 μm不等。细胞内的脂滴通过不断的合成和消耗参与细胞的生理活动。它们在脂肪酸的储存、运输和降解中起关键作用，也参与炎症反应、蛋白质储存和降解以及病毒复制。这些过程与肥胖、神经退行性疾病、癌症、高脂血症及相关疾病的发生密切相关。因此，成像和跟踪细胞内生理活动中脂滴的变化有助于了解疾病形成的机制。通常用于跟踪脂滴的商业探针，如Nile Red和BODIPY 493/503，结构简单，可以靶向脂滴并作为靶向脂滴的官能团，如图所示的脂滴探针。Yoshihara等人报道了一种高量子产率的靶向脂滴(PC6S)的探针，其结构与Nile Red相似。Zhang等也报道了一种与Nile Red结构相似的脂滴探针(C-Py)，其光稳定性优于Nile Red和BODIPY 493/503。Collat等人报道了一种具有窄吸收和发射带的新型脂滴探针(SMCy)，有助于减少多色成像中的串扰。
细胞核靶向
细胞核是真核细胞中最重要的细胞器，它包含了大部分的遗传物质，是细胞遗传学和代谢的调控中心。为了研究细胞核如何参与生物活动，人们开发了以细胞核为靶点的荧光染料，如Hoechst染料和4′，6-二氨基-2-苯基吲哚染料(DAPI)。由于它们对细胞具有很强的渗透性和DNA特异性，这两种染料被广泛用于跟踪细胞核的生理活动。然而，这些染料的共轭系统很小，需要紫外线激发，可能导致细胞损伤和自身荧光。因此，Hoechst染料和DAPI结构常被用作靶向细胞核的官能团，如图所示的核探针。例如，SiRHoechst是一种远红色核靶向染料，它将Hoechst基团与长波长的硅罗丹明(SiR)基团结合在一起。除了Hoechst和DAPI结构外，Peng等人还报道了一种核探针(deb -3)，可以强烈染色核染色体。Tian等人报道了另一种类似Hoechst结构的核探针(MNQI)，由一个弱电子供体和一个带正电的基团组成，对不健康细胞的细胞核进行染色以评估其活力。
内质网靶向
内质网主要调节细胞代谢，尤其是脂肪代谢。它还可以帮助细胞交换亚细胞分子，如蛋白质、碳水化合物和离子，通过细胞间的内质网运输，支持细胞的正常功能。细胞内质网代谢主要受膜系统脂质组成控制。膜系统中的过饱和脂肪酸可引起内质网应激、内质网稳态破坏和细胞死亡。因此，成像和跟踪内质网的生理活动对了解其生物学功能和疾病的发生至关重要。所报道的内质网靶向探针的结构有一个共同的特征，即是一个小的两亲性或亲脂性阳离子基团。Lee等人报道了一种内质网探针(V-1)，它由基于bodipy -香豆素的荧光基团和基于长烷基链(n-C18)的内质网靶向基团组成。Lee等人报道了一种基于bodipy的内质网探针(ER-VisB)来量化局部粘度变化，其中砷酸基团通过靶向vdp作为内质网应力引发剂。Fang等人也利用对甲苯磺酰胺构建了基于bodipy的内质网探针(ER-BDP)来靶向内质网群。Xiao等报道了一种针对内质网的近红外比例探针(ER-P)，利用merocyanine和二氟硼酸基团作为荧光团，分析了糖尿病小鼠肝组织极性的变化。
靶向其他细胞器
除上述细胞器外，高尔基体、质膜等细胞器在细胞的生理活动中也发挥着重要作用。为了研究这些细胞器的生理功能，也开发了相应的靶向基团，如Wang等报道的苯基磺胺作为高尔基靶基团来检测高尔基胁迫时半胱氨酸浓度的变化。十烷基链被证实是质膜靶向基团。
在探针结构中引入了特定的结构基团来靶向特定的细胞器。如TPP和阳离子氮基靶向线粒体，二甲基叔胺靶向溶酶体等。这些细胞器靶向探针的细胞内靶向和积累归因于细胞器微环境的特性。除了通过化学反应引入的细胞器靶向基团外，一些天然化学结构如木兰花碱和小檗碱具有可直接用于靶向细胞器的氮阳离子。仍有一些细胞器的靶群尚未确定，如细胞核和内质网，但这并不妨碍靶向它们的探针的发展。例如，商业上可用的赫斯特染料用于染色细胞核，因此它们可以用于靶向细胞核。通过连接特定的荧光团，可以得到不同荧光波长的核探针。随着对细胞器的深入研究，将发现和设计其他新的细胞器靶向基团的结构特征，为细胞器的定位和细胞生理活动的跟踪提供有力的工具。
亚细胞分子的超分辨荧光成像
以上对小分子探针的重要结构，包括荧光团、结合基团、细胞器靶向基团等进行了全面总结，为超分辨成像提供了理论基础。近年来用于超分辨率成像的具有代表性的小分子探针策略主要遵循上述设计路线。因此，有必要对这些具有代表性的超分辨率探针进行充分的分析，以识别不同的亚细胞分子，包括亚细胞小分子和大分子亚细胞分子，它们是维持细胞正常生理活动所必需的。H2O2、GSH、Zn2+等亚细胞小分子主要参与细胞器的物质交换和信息传递。大的亚细胞分子可以作为能量储备，参与免疫反应，并储存遗传物质，如蛋白质、mtDNA和糖蛋白。因此，识别这些亚细胞分子的小分子探针根据其类型进行分类和总结。在亚细胞水平上分析和跟踪亚细胞分子的动态变化，有助于揭示亚细胞分子异常与疾病状态的关系。
亚细胞小分子超分辨荧光成像
亚细胞小分子包括离子、ROS、RNS和RSS。其中，Zn2+、Na+、K+等离子在生物体中具有重要的生理功能，广泛参与细胞生长、肌肉收缩、信号转导等生命活动。此外，ROS家族主要包括H2O2、超氧阴离子自由基(O2)、脂质过氧化物(ROO·)、羟基自由基(·OH)和臭氧(O3)，它们是由线粒体电子传递链中的电子泄漏产生的。RNS家族主要包括ONOO-、二氧化氮(NO2)和一氧化氮(NO)，一氧化氮是由NO介导的。RSS家族主要包括控制氧化还原稳态的硫化氢(H2S)、HSO3-、同型半胱氨酸(Hcy)、谷胱甘肽(GSH)和半胱氨酸(Cys)。这些亚细胞分子在细胞分裂、信号传导、代谢和免疫等细胞过程中起着关键作用。它们的异常含量与疾病的发生密切相关，可以作为某些疾病的标志。因此，及时准确地检测亚细胞小分子已成为评估细胞稳态调节的有效方法，从而为疾病的预防、诊断和治疗提供有价值的参考。
同时跟踪多个细胞器中的Zn2+
体内Zn2+的波动与各种生理活动和疾病的发生密切相关。Zn2+与细胞信号的调控和传递有关，涉及细胞器的多种生理活动，如自噬导致Zn2+的波动。此外，前列腺癌、糖尿病、神经退行性疾病、脂肪肝等疾病的发生都与Zn2+波动有关，可以作为治疗疾病的潜在靶点。2021年，Fang等人开发了一种方法(ZnSTIMO)，通过将萘酰亚胺衍生的Zn2+探针与SIM结合，同时跟踪多个细胞器中的Zn2+。新型探针通过调节亲脂性靶向多个细胞器，包括线粒体、溶酶体和内质网。CCCP诱导的线粒体自噬与不稳定的Zn2+增强之间的关系被揭示，表明Zn-STIMO可以可靠地跟踪多个细胞器中的Zn2+动态。他们还通过使用NapBu-BPEA将该方法应用于类器官成像，证明Zn-STIMO可以识别细胞器的形态并捕获其中发生的特定生物事件。
线粒体中H2O2的灵敏和快速跟踪
H2O2是最重要的活性氧之一，在许多生物过程中起着至关重要的作用。H2O2水平与不同生物过程的调控有关。其含量异常会破坏蛋白质结构，从而可能导致糖尿病、癌症、神经退行性疾病、帕金森病等。因此，开发一种高灵敏度和高选择性的方法来快速检测细胞内H2O2浓度，可能有助于揭示相关疾病并发现其治疗靶点。Song等人构建了一种新型探针(Mito-Bor)，通过靶向线粒体增强荧光，使其对H2O2作出反应，监测线粒体中H2O2水平的变化。Mito-Bor对H2O2具有高选择性，检测限(LOD)低至23 nM，用于检测细胞纤维化过程中H2O2水平的变化。荧光强度与H2O2水平呈正相关，可作为成纤维细胞氧化应激水平的荧光信号。它也被用于监测肺纤维化小鼠的H2O2水平，其中NADPH氧化酶4显著降低H2O2水平。Yang等人构建了一种基于喹啉的探针(QVDB)来靶向线粒体，该探针具有三种荧光特征，可以分别识别H2O2、蛋白质和核酸。利用QVD-B通过STED可视化H2O2与核酸-蛋白复合物的关系，随着H2O2含量的增加，核酸-蛋白复合物分离。这些结果表明，QVD-B是一种有吸引力的可视化生物事件的工具。
铁下垂过程中线粒体中ClO-的追踪
在所有亚细胞小分子中，ClO-参与许多细胞内生理过程，过量的ClO-可导致多种疾病。因此，及时监测ClO-含量对疾病的预防和治疗具有重要作用。Wei等发现了一种天然的线粒体靶向药物分子，magnnoflorine (MF)，它对ClO-有荧光响应，并将其用于跟踪线粒体中的ClO。MF具有大共轭结构，量子产率高，其结构N阳离子可靶向线粒体。线粒体中ClO-水平的变化首先使用SIM在纳米级水平上可视化。此外，MF用于评价铁下垂过程中ClO-的产生。这些结果表明，MF提供了一种天然的线粒体标记药物，不需要进一步的结构修饰，可以通过荧光准确地观察药物在细胞器中的分布。ClO-也被发现是MF的一个结合靶标，这可能有助于理解疾病发展过程中药物的调控机制。方等人开发了一种近红外探针(HD-Br-1)，用于监测铁下垂期间线粒体中ClO-含量的变化。HD-Br-1对ClO-具有较高的选择性，LOD为89.7 nM，用于检测活细胞中ClO-水平的变化。他们应用HD-Br-1实时监测铁下垂引起的线粒体形态学变化和体内ClO-的变化。他们还将探针应用于肿瘤小鼠成像，发现肿瘤区域的荧光强度比非肿瘤区域强。因此，HD-Br-1可以用于跟踪线粒体中ClO-水平的变化，也可以用于诊断与铁细胞凋亡相关的癌症。Ali等人报道了一种新型探针(SF-1)，可通过检测对溶酶体和高尔基体中的ClO-进行成像，检测限为4.3 nM，可特异性识别和检测活细胞中ClO-水平的变化。当与SIM集成时，SF-1实现了120 nm的横向分辨率，使其成为一种优秀的ClO-探针，作为涉及ClO-的生物事件的荧光示踪剂。
“地雷战策略”追踪线粒体嵴中的ONOO-
ONOO-是一种主要产生于线粒体的RNS，由一氧化氮和超氧阴离子自由基通过快速自由基偶联反应产生。它在生物过程中起氧化和硝化作用。一些神经源性疾病如帕金森病(PD)的发生与细胞内ONOO-含量异常密切相关。监测ONOO-在细胞不同区域的分布可以帮助进一步了解它与某些疾病的关系。2021年，Liu等人报道了一种通过将探测器L-1与SIM相结合来识别ONOO-的“地雷战策略”。该策略解决了探针的非特异性靶向问题，并首次在纳米水平上观察到了线粒体嵴中ONOO-的形成。L-1对ONOO-具有较高的灵敏度，LOD低至85.7 nM。ONOO-与细胞质中的L-1接触时，C=N键断裂，触发荧光发射。此外，L-1被应用于通过刺激脂多糖产生的ONOO-，并发现颗粒状荧光聚集体。这些研究表明，该策略可用于跟踪ONOO-的分布并了解其生物学功能。许多探针已经被报道用于细胞、斑马鱼和小鼠体内ONOO-的超分辨率成像。2021年，Li等人报道了一种近红外和比例探针(CDMS)来识别ONOO-，并将其应用于共聚焦细胞成像和载瘤小鼠成像。2022年，Kang等构建了另一种用于识别ONOO-的近红外比例探测器(KONOO)，用于共聚焦细胞成像和斑马鱼成像。
在线粒体-溶酶体接触位点二色跟踪H2S/HSO3-
H2S和HSO3-作为RSS的重要组成部分，由于其抗菌和抗氧化能力，被广泛用作一般防腐剂来抑制食品、饮料和药品的降解。生物医学研究表明，在环境中频繁暴露于H2S或HSO3-可能会诱发呼吸反应、肺癌和脑癌、神经问题和心血管疾病，因此开发一种在环境和细胞样本中选择性检测它们的传感方法非常重要。Chen等人构建了一种二色探针Coupa，用于跟踪线粒体和溶酶体在线粒体自噬过程中的事件。Coupa在靶向溶酶体时显示红色荧光，但在线粒体中与H2S反应后转化为另一种具有蓝色荧光发射的分子。Coupa被用于观察线粒体-溶酶体接触位点(MLC)，并监测MLC诱导的线粒体局部粘度变化，从而跟踪线粒体自噬和其他生物事件。此外，Fang等人提出了一种“将动态事件转换为静态图像构建”(CDtSC)策略，以纳米分辨率可视化生物活性离子交换。该策略使用单个二色探针作为颜色转换来可视化细胞器接触部位的生物活性离子交换。构建了一个HSO3-敏感的二色荧光探针(CHS)来可视化MLC上的HSO3-交换，并表明HSO3-与细胞器接触信息交换有关。
实时跟踪线粒体内谷胱甘肽
谷胱甘肽(GSH)是RSS的重要成分，分布于细胞的不同区域，参与许多细胞生理活动。谷胱甘肽主要在线粒体中起抗氧化作用，这使得它可以限制潜在的氧化损伤。因此，了解细胞内谷胱甘肽含量的快速变化对于进一步了解谷胱甘肽的生物学意义至关重要。Chen等人报道了一种线粒体靶向荧光探针(MitoRT)，用于实时显示线粒体内谷胱甘肽的动态变化。MitoRT由一个线粒体靶向功能基团TPP和一个Michael受体结合物GSH组成，它们通过一个优化的4碳连接体连接。MitoRT与GSH结合时表现出比例荧光，这使得它能够揭示活细胞优先维持线粒体GSH水平的生物学现象。Morozumi等人报道了一种新的双色活细胞单分子定位显微镜成像原理，利用谷胱甘肽和一种基于杂蒽的探针(CP550)的可逆反应。他们将其应用于在没有成像介质支持的情况下可视化微管或线粒体。
亚细胞大分子超分辨荧光成像
亚细胞大分子构成了基本的生物物质，包括蛋白质、核酸、多糖和脂质。蛋白质是由氨基酸组成的聚合物，参与细胞内许多重要的生化过程，包括催化反应、结构支持和信号转导。核酸包括核苷酸，可分为DNA和RNA分子，其中DNA是细胞遗传学信息的储存库，RNA在蛋白质合成中起着重要作用。多糖是由单糖分子组成的链或支链聚合物，主要为细胞提供能量。脂类主要包括脂肪酸和甘油，它们在细胞膜中起着重要的结构和功能作用。这些大的亚细胞分子在细胞内密切相互作用，协同完成各种生理过程。
追踪线粒体中的蛋白质
蛋白质是生物体的基本组成部分，参与维持正常的代谢，包括各种重要的生理亚细胞分子，如酶和激素。例如，酶蛋白促进食物的消化、吸收和利用;胶原蛋白促进伤口愈合;免疫球蛋白参与防御细菌入侵;肌球蛋白调节肌肉收缩;血液中的血红蛋白参与运输氧气;甲状腺激素促进生长发育。蛋白质的监测和可视化可以促进我们对其在细胞生理活动中的功能的理解。Thiel等人报道了一种基于罗丹明的化学探针1，并将其用于线粒体中硝基还原酶的超分辨率成像。探针上的硝基可以与硝基还原酶反应并产生荧光响应。他们利用双色、三维和单分子定位显微镜对亚线粒体组织进行成像。结果表明，硝基还原酶主要存在于线粒体内，分布不均匀，呈聚集态。Ye等人还报道了一种基于罗丹明的新型探针(Rh-Gly)，用于靶向线粒体，具有优异的时间分辨率和高精度定位。Rh-Gly被HaloTag配体修饰为靶向组蛋白H2B的Rh-Gly- halo，这表明Rh-Gly具有扩展的功能。同样，将Rh-Gly修饰为含有异硫氰酸酯基团的Rh-Gly- ncs，用于靶向α-微管蛋白和二抗的一抗。Rh-Gly-NCS用于固定细胞微管的超分辨率成像。这些结果表明，RhGly为PALM成像提供了一个有吸引力的工具，也为开发罗丹明探针提供了一个新的研究工具。Chen等构建了针对线粒体外膜vdp的荧光探针1-Cy5，并利用STORM对活细胞线粒体进行成像。探针通过与线粒体膜上的1-VDP结合，荧光观察线粒体的融合、分裂和管状。
追踪线粒体中mtDNA的变化
mtDNA是一种存在于线粒体中的具有环状和双链结构的遗传物质，负责编码线粒体内参与电子传递链的酶和蛋白质。mtDNA是自我复制的，但这个过程是由核DNA控制的，因为它的DNA复制聚合酶是由核DNA编码的。由于mtDNA对过氧化物的敏感性、不完全的自愈功能以及缺乏组蛋白保护，mtDNA发生突变的概率高于细胞核。目前它是癌症形成的主要因素之一，许多遗传疾病都与mtDNA有关。因此，实时跟踪mtDNA生理形态的变化对疾病的预防和治疗至关重要。然而，目前常用的mtDNA监测技术，包括荧光原位杂交(FISH)或聚合酶链反应(PCR)，其重复性差，杂交程度低，因此需要开发一种高精度、实时的mtDNA定位和成像策略。
Gao等人构建了一种具有大Stokes位移的新型荧光探针CNQ，用于识别活细胞中的mtDNA。咔唑基CNQ与mtDNA具有合适的小凹槽结合模式，之后CNQ的荧光增加了182倍，Stokes位移为140 nm。体外活性测试表明，CNQ能特异性识别mtDNA。SIM共定位成像实验表明，CNQ可以靶向活细胞中的mtDNA，并且还可以监测阿霉素诱导的mtDNA损伤。这些结果表明CNQ是一种很有前途的靶向mtDNA的化学工具。Uno等人构建了一系列长吸收波长的n -芳基吡啶半菁胺基DNA靶向探针，在STED的支持下，应用于各种细胞类型的超分辨率可视化DNA时，显示出高DNA特异性和强膜透性。
Wang等人构建了一种同时靶向线粒体脂质和mtDNA的探针(MitoMN)，用于成像线粒体内的动态过程。MitoMN的蓝色荧光与商用线粒体脂质染料MTR的共定位高度重叠，表明MitoMN的蓝色荧光来自线粒体脂质。MitoMN的绿色荧光与同源polg2 - mcherry等离子体具有较高的共定位值，表明MitoMN的绿色荧光来自mtDNA。利用MitoMN可视化光刺激下肿瘤的线粒体动力学，包括线粒体肿胀、体积增加和最终的癌症凋亡。双靶MitoMN揭示了在SIM支持下肿胀线粒体之间的相互作用和融合，并表明这一过程是不可逆的。这些结果表明，MitoMN是一种有用的荧光工具，可用于观察肿瘤加速发展之前、期间和之后的亚细胞动态变化。
Chen等人设计了一系列靶向mtDNA的探针，其中MitoISCH特异性荧光靶向mtDNA G4。MitoISCH通过线粒体靶向组TPP传递到线粒体，与mtDNA G4结合，在650 nm处荧光明显增强。MitoISCH与TFAM和MitoTracker的共定位实验表明，MitoISCH与mtDNA G4结合，表明MitoISCH是监测活细胞中mtDNA G4动态的有吸引力的工具。MitoISCH揭示了mtDNA G4、糖酵解和癌细胞之间的关系。这些研究表明，mtDNA G4可能为癌症治疗和进一步研究提供新的癌症生物标志物。
总结
本文综述了荧光探针与超分辨率成像技术在实时监测细胞器超微结构亚细胞分子动态变化中的应用。可根据研究需要组装常见荧光团、亚细胞分子结合基团和细胞器靶向基团三种主要结构，便于合理设计各种小分子荧光探针。这些荧光探针为亚细胞分子的荧光跟踪提供了不同程度的可视化。根据以上报道和总结，结合超分辨荧光成像的荧光探针已成为跟踪亚细胞分子动力学的首选解决方案。该领域未来发展前景广阔。
参考文献
Single-organelle localization-based super-resolution imaging for subcellular molecules micro-dynamics. Guiqian Fang , Daili Liu , Mengrui Zhang , Liwei Shao , Xintian Shao, Jia Chen, Caicai Meng, Yanfeng Wang, Kewu Zeng, Qixin Chen * ,Coordination Chemistry Reviews 504 (2024) 215670 , https://doi.org/10.1016/j.ccr.2024.215670
