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内容提要

  本文全面的综述针对体内成像的小分子PA探针。我们深入研究了它们的基本设计策略，光物理特性和复杂的响应机制，旨在促进生物传感和成像的未来创新。探针根据其检测和成像关键生物活性物质的效用进行系统分类，包括金属离子、活性氧、活性氮、缺氧、生物硫醇、酶、pH值和极性。最后，我们讨论了当前的局限性，并概述了未来的前景，以激发化学、化学生物学和生物医学等跨学科领域的持续研究。

小分子PA探针的设计

光声信号产生的机理

   小分子探针中PA信号产生的机制涉及特定波长光子的有效吸收。这种吸收以电子方式将分子从基态（S₀）激发到更高的单线态（S_n）。这些被激发的分子随后经历快速的非辐射弛豫过程，如内部转换和振动弛豫，在皮秒到纳秒的时间尺度上以热的形式向周围介质释放能量。瞬态局部温度升高引起热弹性膨胀，产生声波。这些声信号随后被超声波换能器检测并重建成高分辨率图像由于涉及复杂的激发态光物理过程，微调小分子的PA转换效率仍然是一个重大挑战。人们普遍认为，降低荧光量子产率（Ff）可以增强PA信号强度，这一原理已在大量研究中得到证实。例如，半菁染料的Ff可以通过引入重原子如硫或硒来抑制，从而能够有效地调节其PA特性。值得注意的是，这种结构调制可以导致平衡的荧光和PA性能，使发色团适合于结合荧光和PA技术的双模成像。然而，Ff本身并不能完全解释所有发色团的PA性能。根据Rochford等人的研究，发色团的PA效率不仅与激发态寿命(t)有关，还受到激光能量和光子吸收模式的影响。基于他们的开创性工作，小分子PA发色团可以根据其PA产生机制大致分为三种类型：

   (1)S₁-S₀快速衰减的线吸收PA发色团：这些发色团被脉冲激光激发产生PA信号，其激发态t明显短于激光脉冲持续时间（tlaser）。这允许在单个激光脉冲内多个激发-衰减周期（S0-S1-S0），显着提高了PA效率。在这种情况下，激发态吸收可以忽略不计。引入分子转子或异构单元，使激发态的构象发生变化，可以进一步加速这一循环。例如，Thorn-Seshold等人最近的研究表明，将基于偶氮的分子开关集成到近红外（NIR）发色团中，S1-S0衰减率提高了两个数量级以上，从而使PA信号稳定性提高了41000倍。

   (2)饱和吸收的PA发色团：这些发色团虽然也表现出可以忽略不计的激发态吸收，但其激发态寿命明显长于激光脉冲持续时间。这种不匹配限制了每个脉冲的激发衰减周期的数量，从而限制了PA信号的产生。此外，这些染料在高激光影响下更容易发生光漂白。

   (3)具有长激发态的非线性吸收PA发色团：这些发色团不仅具有超过激光脉冲持续时间的长激发态寿命，而且还具有激发态吸收能力。随着激光能量密度的增大，其声压信号呈非线性增强。因此，这些染料可以在获得强PA反应的同时保持高Ff。例如，Rochford等人发现某些具有非线性吸收特性的BODIPY衍生物具有高Ff（高达72%），但由于其S1寿命延长，仍然产生鲁棒的PA信号虽然这种发色团显示出双峰成像的巨大潜力，结合了高荧光效率和强PA性能，但对高功率脉冲激光器的要求存在实际限制，包括光漂白和光热组织损伤的风险增加。

分子平台的PA探针设计

   小分子PA探针的开发需要仔细考虑各种参数，包括吸收截面、非辐射衰变效率、生物相容性、功能化性和分子大小。理想的发色团平台应在近红外（650-900 nm）或短波红外窗口（1000 - 1700 nm）内具有最大的吸收，在生理条件下保持化学和光物理稳定性，并且在成像后易于从体内消除。大多数报道的小分子PA探针都来源于经典的荧光基团支架，如花青素、半花青素、卟啉、BODIPYs、黄原烯和罗丹明。虽然这些平台表现出不同程度的近红外吸收，但由于缺乏系统的结构-性能关系研究，对其PA性能的基本了解仍然有限，这限制了它们的合理修改和更广泛的适用性。

   花青素染料，作为经典的荧光团优良的生物相容性，已被广泛研究过。这些年来，人们对它们的化学结构、荧光特性和生物医学成像应用之间的关系有了深入的了解。然而，它们在PA成像和PA探头设计中的应用仍处于起步阶段。特别是新开发的高吸波菁染料，其PA特性尚未得到系统的研究在目前使用的PA发色团中，半花青氨酸衍生物因其在荧光和PA性能之间良好的平衡、结构可调性和高稳定性而成为应用最广泛的一类。然而，值得注意的是，这些染料中的大多数在800 nm以下表现出最大吸收，这使得构建在700-1400 nm的最佳PA成像窗口内工作的比率探针变得困难。

   卟啉类发色团作为血红素的类似物，具有良好的生物相容性。然而，它们的吸收波长与血红蛋白的吸收波长有很大的重叠，这可能会对PA信号的采集造成干扰。BODIPY衍生物属于卟啉家族，具有出色的PA性能和结构可改性性，其吸收波长跨越近红外到SWIR区域然而，它们的高亲脂性对提高水溶性提出了重大挑战，这对探针的设计和合成至关重要。与花青素染料类似，其他荧光团如黄原和罗丹明在荧光成像方面取得了巨大的成功。然而，它们的PA性能仍然受到吸收波长短（o800 nm）和难以平衡荧光量子产率与PA信号效率的限制。

   研究人员正在积极探索替代发色团，如姜黄素类似物、偶氮苯-花青素杂交体和方菁，并采用结构工程来改善它们的近红外吸收和非辐射衰变谱。

信号激活和感知机制

   PA探针通常通过两种主要的响应模式与特定的生物分析物相互作用：“打开”和比率信号调制。“开启”探针在分析物识别时表现出从低背景到高强度PA信号的明显切换，提供高成像对比度。相比之下，比率探针在分析物相互作用前后发射两种不同波长的PA信号，通过计算信号比实现自校准。这种模式最大限度地减少了探针浓度变化、内源性吸收剂或激光功率波动带来的伪影，从而提高了定量准确性。以下部分概述了支持这些响应类型的主要分子机制。

光致电子转移（PET）

   基于PET机制的探针通过调节激发态辐射和非辐射衰变途径之间的平衡来调节PA信号输出，这取决于它们与目标物质的相互作用。在相互作用之前，PET过程通常发生在响应部分和PA发色团之间，反之亦然。这种PeT过程促进了激发态的非辐射弛豫，从而增强了PA信号。在与目标分析物相互作用后，分子内PET过程被抑制，增加了辐射衰减的概率，导致荧光增强，而非辐射衰减的概率降低，导致PA信号减弱。这是目前探针设计中最常用的机制。

共轭激活信号的产生

   共轭激活的PA信号传导机制依赖于探针内潜在反应基团的存在，该反应基团可以选择性地对目标分析物做出反应。一经识别，分析物和反应片段之间的相互作用就会引发化学转化，从而扩展发色团的偶联性。这种结构变化通常导致吸收光谱中的色移，通常进入近红外区域，导致PA信号的显着增强。这种从“静音”状态到“激活”状态的转变对于实现高对比度PA成像非常有利，因为它可以最大限度地减少背景信号，并在目标接触时最大化信噪比。

分子内电荷转移（ICT）

   基于信息通信技术的探针通过调节发色团末端的电子捐赠或撤回能力来响应分析物。分析物触发的ICT强度变化导致吸收光谱的深变色或次变色变化。这些光谱位移导致在不同波长的PA输出相应的变化，这是理想的比率成像。

共振能量转移（FRET）

   基于FRET的PA探针的设计通常涉及在单个分子内结合供体-受体发色团对，通过柔性连接剂连接。在未反应（自由）状态下，供体的发射光谱与受体的吸收光谱重叠，允许能量通过FRET机制从受激发的供体向受体有效转移这种非辐射能量转移降低了供体的PA信号强度与其原生状态相比。在与目标分析物相互作用时，供体或受体部分的结构或电子变化可以调节FRET效率。结果，供体或受体的PA信号相应增强或减弱。通过监测供体和受体波长的PA信号变化，可以实现比例响应，从而更准确和定量地检测分析物。

组装和拆卸

   与靶物种相互作用时分子聚集的调节是另一种很有前途的PA探针设计策略在这种方法中，探针最初可能以聚集形式存在，如j聚集体或h聚集体。与单体形式相比，j -聚集体表现出典型的深色移吸收光谱，而h -聚集体由于激子耦合而导致亚深色移吸收光谱此外，聚集体内部分子间相互作用的增加通常会增加激发态非辐射衰变的概率，从而导致更强的PA信号。一旦识别目标分析物，分子间的相互作用可能被破坏，导致聚集体分解成单体探针。这种转变通常伴随着频谱移位和PA信号强度的显著变化。相反，相反的过程也是可行的，其中探针最初以单体状态存在并经历目标触发的聚合。在这种情况下，与拆卸过程相比，PA信号变化遵循相反的趋势。

小分子PA探针的研究进展

PA探针用于金属离子成像

PA Ca²⁺ PA探针

   Ca²⁺是参与许多生理过程的关键细胞内信使虽然已经开发了几种用于Ca²⁺的荧光探针，成功地分析了它们在细胞内的动态变化，但用于Ca²⁺的PA探针的开发仍然面临着重大挑战。Westmeyer及其同事率先开发了用于Ca²⁺成像的小分子PA探针。他们用钙螯合剂修饰了IR780的中间位置，IR780是一种经典的花青素染料，用作PA发色团。在没有Ca²⁺的情况下，从螯合剂到发色团的PeT效应会猝灭荧光并增强非辐射衰减，从而产生强烈的PA信号。Ca²⁺结合后，PeT效应被抑制，导致荧光增强，PA信号减弱。这种信号变化被证明是可逆的加入乙二胺四乙酸（EDTA）作为竞争配体。Ca²⁺配合物的解离常数（Kd）为11.3 mM，探针对Ca²⁺的选择性反应优于其他金属离子，如Mg²⁺，Zn²⁺和Cu²⁺。

   Westmeyer等人随后开发了CaSPA_550，这是第一个用于体内Ca²⁺成像的小分子PA探针受荧光Ca²⁺探针fura-2的启发，他们将BAPTA螯合剂偶联到萘噻哚盐支架上。Ca²⁺配位后，BAPTA的给电子能力减弱，ICT效应减弱，并导致吸收最大值（实验室）至455nm的异色偏移，同时伴随着550nm处PA信号的下降。Ca²⁺的Kd为4 mM，竞争实验证实了其对Mg²⁺，Zn²⁺和Cu²⁺的选择性。

检测Zn²⁺PA探针

   Zn²⁺是多种酶必不可少的结构辅因子，在维持蛋白质结构稳定、调节基因表达、介导细胞内信号转导等方面发挥着重要作用。锌体内平衡失调与神经退行性疾病、糖尿病和免疫紊乱等病理有关。因此，利用分子探针对Zn²⁺动态波动进行高分辨率的体内成像，对于阐明其生理和病理作用具有重要意义。最近，Zhao和He团队独立开发了两种锌响应的PA探针，为体内双Zn²⁺-PA成像提供了初步验证。Zhao等人设计了CR-1比例化PA探针，将Zn²⁺结合配体三（2-吡啶基甲基）胺（TMPA）结合到菁染料IR825.62中，当Zn²⁺配位时，TMPA单元中的五个氮原子与Zn²⁺螯合，导致IR825上邻近的氮原子去质子化。这导致IR825内部的双键重排，削弱其p偶联，并导致实验室中从710 nm到532 nm的显着的低色移。在710和532 nm处PA信号比的变化（PA710/PA532）提供了Zn²⁺的比率读数。选择性研究表明，Zn2比其他生物相关金属离子具有更高的特异性。Zn²⁺配合物的Kd值为4.3 nM。在一项概念验证实验中，将CR-1和Zn²⁺皮下注射到小鼠大腿区域，随后覆盖鸡胸组织以模拟深层组织状况，证实了探针可视化深层组织中Zn²⁺分布的能力，展示了其在体内的成像潜力。

   He等人开发了HD-Zn，另一种比例式PA探针。该探针基于与2-双（吡啶-2-甲基）氨基)苯酚（BPAP）偶联的半花青素发色团，aZn²⁺-螯合配体。Zn²⁺配位后，杂蒽部分6位的酚羟基给电子能力减弱，ICT减弱，并引起λ_abs从750 nm到663 nm的色移。该探针具有很强的Zn²⁺结合亲和力，Kd值为8.08 pM，适合检测体内不稳定的Zn²⁺池。体外PA成像显示，与Zn²⁺结合后，PA₆₈₀/PA₇₅₀值增加了约11倍，这种反应可以用强螯合剂N,N,N’,N’-四基斯（2-吡啶基甲基）-1,2-乙二胺（TPEN）逆转。随后在小鼠后肢皮下注射HD-Zn和ZnCl₂后，PA信号比增加了近2倍，进一步证实了探针在生命系统中比例Zn²⁺成像的能力。

PA探针Cu⁺/Cu²⁺

   Cu⁺作为重要的电子载体，参与细胞色素c氧化酶等关键酶的催化活性。Cu⁺在线粒体呼吸、抗氧化防御（通过Cu⁺/Zn超氧化物歧化酶）、神经递质合成和结缔组织形成中发挥重要作用。Cu⁺稳态的破坏与Menkes病、Wilson病（WD）和神经变性等疾病有关。基于活性依赖或协调介导的反应机制，已经开发了各种Cu⁺/Cu²⁺的PA探针。Yamamoto等人和Chang等人先前开发了一系列基于活性的Cu⁺荧光探针，使用Cu⁺触发的去苄化机制，在细胞水平上显示出出色的Cu+响应性。基于这一策略，Chan等人设计了PACu-1，一种比例化的PA探针，采用aza-BODIPY作为PA发色团，三（2-吡啶基甲基）胺（TPA）作为Cu⁺选择性螯合剂。Cu⁺结合触发苄基醚连接体的氧化裂解，释放aza-BODIPY发色团并生成Cu²⁺-TPA。由此产生的酚羟基的去质子化增强了ICT效应，将λ_abs从678 nm移到767 nm。在BALB/c小鼠体内验证表明PACu-1可以可视化肝脏铜水平。随后，该探针被用于检测WD和肝脏代谢小鼠模型中的不稳定Cu⁺池。

   Chan和New及其团队分别独立开发了两种Cu2+响应比率型PA探针APC-2和CyCu1两种探针都通过双Cu²⁺诱导的酯水解机制工作。具体来说，Cu²⁺与2-吡啶酯部分的配位触发水解，从而释放aza-BODIPY（对于APC-2）或CyK1（对于CyCu1）。该反应调节了探针内的ICT效应：对于APC-2，这导致λ_abs的色移从697 nm到767 nm。对于CyCu1，它引起了从784 nm到526 nm的色移。APC-2的反应速率常数为2.66×10^-2 min^-1，CyCu1为1.57×10^-3 s^-1。这些变化导致PA信号的显著变化：APC-2增加100.5倍，而CyCu1减少10倍。在应用方面，APC-2展示了在1厘米厚琼脂糖基组织模体中进行深层组织Cu²⁺成像的能力。另一方面，CyCu1在活体小鼠肝脏Cu²⁺成像中显示了初步的可行性。

   开发用于大脑中Cu²⁺实时动态成像的分子探针对于了解其在神经系统疾病中的调节和致病作用至关重要。然而，实时脑Cu²⁺成像对探针的设计提出了一些挑战，包括血脑屏障（BBB）渗透性、深部组织穿透性和高空间分辨率的必要性。传统的PA探针通常依赖于扩展的p共轭来实现近红外吸收，这通常阻碍了它们穿过血脑屏障的能力。Donnelly等人发现N1， n2 -二（2-（吡啶-2yl）乙基）苯-1,2-二胺不仅具有很强的Cu2结合亲和力，而且在700 nm左右产生Cu2诱导的强吸收自由基阳离子，使其成为一种很有前途的pa反应支架。在此基础上，Zhang等人在二胺支架的3位置引入了一个N，N-二甲基苯胺基团来构建RPS1，这是第一个能够穿透血脑屏障的Cu²⁺PA探针。在Cu2+配位后，RPS1在710 nm处有明显的自由基阳离子吸收峰，并伴有明显的PA响应。该探针对Cu²⁺的结合常数为1.18×10^-4 m^-1，与Cu²⁺对淀粉样蛋白b上第二个结合位点的亲和力相当。RPS1在阿尔茨海默病（AD）模型小鼠中激活Cu²⁺的体内PA成像，显示与WT对照组相比，大脑中平均PA强度增加了9.57倍。这为Cu²⁺失调与AD发病机制之间的联系提供了强有力的证据。

PA探针用于活性氧/氮/碳

   活性氧（ROS）、活性氮（RNS）和活性碳（RCS）在健康生理功能和疾病过程中都起着至关重要的作用。它们作为重要的信号分子，参与从细胞增殖、神经传递到免疫反应的一切活动。然而，ROS、RNS或RCS的过量产生会导致氧化应激，引发炎症和细胞损伤。这种压力最终会导致癌症、心血管疾病和神经退行性疾病等严重疾病的发展。

过氧化氢（H₂O₂）探针

   H₂O₂触发芳基硼酸或硼酸酯转化为酚类是一种成熟的荧光探针设计策略，成功地适用于PA探针的开发通过在PA发色团的供电子位点加入芳基硼酸或硼酸酯基团，H₂O₂介导的水解释放出供电子部分。这一过程激活或增强ICT，从而导致色移吸收。反应前后PA信号的变化使H₂O₂的比例传感和成像成为可能。基于这一原理，Huang等人在aza-BODIPY的3位上引入硼酸芳基修饰的季铵基，设计了一种比例探针（OEG-Aza-BODIPY-BAPE）。当暴露于H₂O₂时，硼酸基团的水解将吸电子的季铵转化为给电子的二甲氨基。这增强了ICT和λ_abs从720 nm到825 nm的色移。PA₈₂₅/PA₇₂₅值增加了4.77倍。体内3D PA成像可以实现肿瘤病变中H₂O₂的比例可视化，与体外校准相比，可以估计肿瘤中平均H₂O₂浓度约为60 mM。

   Wang和Chan及其团队独立开发了两种PA探针，TPA-QO-B和PA-hd– H₂O₂，他们用4-硼酸苄醚修饰氧/硫桥接的杂蒽基半苯胺的6羟基位置在H₂O₂介导的裂解过程中，在6位形成一个酚羟基，激活ICT，使实验室发生色移，增强PA信号。这些探针基于两个波长的PA信号比实现了H₂O₂的比例成像。在脂多糖（LPS）诱导的炎症小鼠模型中，TPA-QO-B在炎症组织中显示出2倍的PA信号增加。在动脉粥样硬化（AS）模型中，与健康对照组相比，AS组755 nm处的探针信号增加了近3倍，表明主动脉组织中H2O2升高。在AD模型中，PA-HD-H₂O₂显示皮层区域PA₇₃₅/PA₆₆₀比值增加1.44倍，证明其在AD研究中的实用性。

 PA探针检测一氧化氮（NO）

   一氧化氮是一种对多种生理和病理过程至关重要的多功能信号分子。除了在细胞信号传导中的作用外，NO还与神经退行性疾病和癌症的进展密切相关。有趣的是，NO在疾病发展和治疗过程中表现出双重作用：它在炎症、癌症、PD和AD中经常过量产生，而高浓度的NO也可以发挥治疗作用。因此，体内NO动态的实时、高分辨率和定量成像对于阐明其多种生物学功能至关重要。一种广泛使用的设计策略涉及芳胺的n-亚硝化。当芳胺与PA发色团偶联时，它们被NO亚硝化抑制了ICT效应，导致吸收和发射光谱的低色移。该反应对NO的选择性高于其他生物物种，使其成为比率NO探针设计的坚实基础。利用这种策略，Chan及其同事开发了APNO-5，这是一种基于3-邻甲氧基苯胺- azabodipy支架的比例探针在与NO反应后，胺基亚硝化抑制了ICT效应，将实验室从764 nm转移到673 nm。LPS诱导小鼠炎症模型的体内成像研究显示，NO激活后，PA信号比（PA₆₇₃/PA₇₆₄）增加1.2倍。为了提高灵敏度，同一组通过在1,7位引入更强的给电子噻吩单元来设计SRAPNO-3这导致在实验室中进一步的色移到790 nm和704 nm， PA₇₀₄/PA₇₉₀比率增加了4.4倍。应用SR-APNO-3在4T1肿瘤模型中显示1.22倍的比例增加，而用NO合成酶抑制剂l- ng -单甲基精氨酸（L-NMMA）治疗后降低81%，证实了原位亚硝化和深部肿瘤组织NO的有效成像。

   花菁染料中位氨基的亚硝化可使λ_abs发生约200 nm的色移，并增强了PA信号。例如，HC-N，一种基于cy7的探针，在与NO反应后显示出从660 nm到865 nm的λ_abs变化。在LPS诱导的急性皮炎和碘乙酸钠（MIA）诱导的关节炎小鼠模型中，HCN选择性地对炎症组织中的NO产生反应，从而通过PA成像准确定位和评估炎症严重程度。SWIR探针的发展进一步推动了NO成像的发展。APNO-1080建立在SWIR荧光团Et-1080的基础上，在与NO反应后将其λ_abs从874 nm转移到1080 nm。在原位乳腺和异位肺肿瘤模型中，APNO-1080使PA₁₀₈₀/PA₈₇₄值增加1.3-1.65，这是首次成功的PA探针在SWIR区域进行深部组织NO成像（图9c）。另一种有效的no反应机制是邻苯二胺的亚硝化反应，产生苯并三唑衍生物。Zhang等人设计了以苯并[c][1,2,5]噻二唑-5,6-二胺（AB）为no敏感基团，以二苯胺为4,7位给电子基团的探针PS。AB与NO反应生成苯并三唑（TB），具有更强的吸电子能力。这增强了ICT效果，并将λ_abs从368nm转移到568nm。在LPS诱导的炎症模型小鼠中，PS在病变组织中表现出明显的PA信号增强，从而能够局部检测NO。基于相同的反应机理，用三苯胺衍生物取代AB取代基得到了OTTAB和BNDA。这些探针进一步与1,2二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺- n-[聚乙二醇（2000）]（DSPE-PEG₂₀₀₀）或羟丙基-b-环糊精组装，以提高水溶性和生物相容性。该探针在LPS诱导的脑炎和对乙酰氨基酚（APAP）诱导的肝损伤小鼠模型中成功实现了NO的PA成像，显示了在脑和肝脏炎症诊断和治疗方面的临床应用潜力。

超氧阴离子（O₂^·-）的PA探针

   O₂^·-作为初级活性氧，在氧化应激中起核心作用，并作为其他活性氧的前体。因此，O₂^·-水平升高是氧化应激的关键指标，其异常积累与各种疾病的发生和进展密切相关因此，开发能够在体内检测O₂^·-的PA探针对疾病的早期诊断和治疗监测具有很大的前景。鉴于O₂^·-的高度氧化性质，大多数报道的用于检测其的PA探针都是基于两种主要反应策略设计的：O₂^·-诱导的三氟甲烷磺酸（CF₃SO₂^-）基团的脱保护和对茶酚部分的氧化。在这些设计中，CF₃SO₂^-基团或儿茶酚基团附着在PA发色团上。在与O₂^·-反应时，CF₃SO₂^-基团被裂解释放PA发色团，或者儿茶酚被氧化成醌。这两种转换都导致了发色团内ICT效应的调制。这种调制导致吸收波长的移位和相应的PA信号的变化，从而使比例PA检测O₂^·-成为可能。

   O₂^·-对CF₃SO₂基团的去保护也使PA探头设计成为可能。通过在杂蒽单元6位引入CF₃SO₂基团，设计了四种基于半菁氨酸衍生物的探针（QLX、hCy-CA-Tf、AIH-OTF和ORM）。在与O₂^·-反应后，CF₃SO₂基团的切割增强了ICT效应，并将实验室的色移到730-780 nm范围内，触发PA信号激活。这些探针能够在多种疾病模型中实现体内氧成像。QLX可视化类风湿关节炎模型炎症关节中O₂^·-水平升高，突出其在早期诊断和治疗评估中的应用。hCy-CA-Tf配以胆酸靶向组，在急性肝损伤模型中实现肝脏O₂^·-靶向成像。AIH-OTF缺乏靶向组，在apap诱导的肝毒性中通过代谢摄取实现肝脏成像。通过将ORM与半导体聚合物（OIM）结合作为内部PA参比，进一步设计的比例纳米探针在lpinduced炎症模型小鼠中实现了690 nm和800 nm激发下对O₂^·-的敏感双通道成像。Yuan等通过将CF₃SO₂基团和半乳糖整合到aza-BODIPY或BODIPY支架中，自主开发了肝脏靶向PA探针AP和BDP_OS2。在O₂^·-反应中，由于发色团的释放，ICT效应增加，色移λ_abs分别从648 nm和745 nm到698 nm和815 nm。在异烟肼(INH)-和apap诱导的肝损伤模型中，这两种探针均显示肝脏积聚，并能够实时PA监测O₂^·-波动。

羟基自由基PA探针

   羟基自由基（-OH）与体内氧化应激水平升高密切相关。由于其与内源性生物分子（包括氨基酸、蛋白质和DNA）的高反应性，-OH具有极强的毒性，可诱导细胞死亡因此，过量-OH的产生与各种疾病的发生和进展有关，同时也为靶向和杀死病理细胞提供了潜在的治疗策略。六芳基丁二烯是一种有机电致变色材料（EM），可以通过与-OH的单电子转移快速氧化为EM²⁺。这个过程伴随着吸收波长的色移和荧光的猝灭，同时激活近红外PA信号。值得注意的是，该反应是可逆的，再生的EM²⁺可以被H₂S还原回EM。基于这种响应机制，Ye等人将EM与半导体聚合物pcpdbt和DSPE-PEG₂₀₀₀共组装，得到了纳米探针1-PAIN。该探针可以通过-OH氧化和H₂S还原触发690 nm处的PA信号“关断”，同时保持来自PCPDTBT的稳定参考信号在825 nm处。PA₆₉₀/PA₈₂₅比值的变化可以同时检测-OH和H₂S。1-PAIN可以实时监测小鼠体内外源性和内源性-OH/H₂S水平的变化。在LPS诱导的肝脏炎症过程中，690 nm通道的信号明显增加，其中PA₆₉₀/PA₈₂₅上升约2倍。NAC处理后，通过产生H₂S使PA₆₉₀/PA₈₂₅的比值恢复到正常水平。这些结果表明，探针能够通过监测-OH的氧化和H₂S的还原，提供有关肝脏炎症期间氧化还原波动和随后抗炎治疗的动态信息。使用类似的设计策略，Ye等人开发了一种-OH特异性PA发色团，1-Br-Et，源自具有取代基的丁二烯框架。使用嵌段聚合物DSPE-PEG₂₀₀₀将其与染料NIR775和IR1048共组装，以创建比率型纳米探针1-NP。在与-OH反应后，1-Br-Et迅速氧化为2-BrEt，导致λ_abs的色移从436 nm到767 nm，并在755 nm激活PA信号。同时，IR1048在905 nm处的PA信号保持“常亮”状态，导致PA₇₅₅/PA₉₀₅的比值增加了约22倍。在活体小鼠中，该探针对芬顿试剂诱导的-OH生成反应迅速。用叶酸修饰探针得到1NP-FA，不仅具有肿瘤靶向能力，而且便于铁下垂和放疗时-OH的比值成像。

PA探针次氯酸盐（OCI^-）

   OCI^-在免疫系统对感染的反应中起着至关重要的作用，但也与慢性炎症和某些癌症的进展有关。在中性粒细胞中，超过70%产生的H₂O₂由髓过氧化物酶（MPO）催化与Cl^-离子反应，将其转化为次氯酸（HOCl）。目前OCl^- PA探针的设计主要采用三种策略：(1)氧化硫醚形成甲基磺酰基罗丹明，激活共轭结构产生PA信号；(2)酚类氧化为醌类，扩展了共轭结构，引起吸收光谱的色移，从而激活了波长更长的PA信号，用于比率响应；和(3)OCl^-加入酰胺羰基的缺电子碳原子，触发酰胺键裂解，增强共轭结构，增强PA信号。利用硫醚氧化策略，Urano等人开发了一种PA探针PA- mmsinq，该探针基于对OCI^-有反应的硅罗丹明衍生物。经OCI^-氧化后，探针的硫醚结构打开，恢复硅-罗丹明的共轭结构，激活660 nm处的PA信号。此外，在杂蒽的N原子上引入4-磺酰基增加了激发态非辐射跃迁的可能性，与3,6二甲氨基取代的硅罗丹明衍生物相比，增强了PA的性能。作者通过对小鼠皮下注射HOCl的3D PA成像证明了该探针在体内应用的潜力。同样，staints等人设计了SNR₇₀₀-HOCl探针，用硫代膦内布拉斯加红（NR）代替硅-罗丹明，与PA-MMSiNQ相比，获得了更好的响应性用硫代膦酸盐取代硅将实验室的波长转移到690 nm，使探针更适合近红外PA成像。与OCI^-反应后，SNR₇₀₀-HOCl的PA信号比PA- mmsinq增强了约2.2倍。体外成像结果表明，SNR₇₀₀-HOCl可以实现2.9 cm深度OCl的PA成像，证明其具有深部组织成像能力。

过氧亚硝酸盐（ONOO^-）的PA探针

   ONOO^-是由NO和O₂^-之间的扩散控制反应产生的ROS，具有很强的氧化和硝化能力。在生理水平上，ONOO^-在免疫系统的抗菌反应和信号转导中具有积极作用。然而，病理水平的ONOO^-会破坏脂质、核酸和蛋白质等大分子的生物学功能，是炎症、糖尿病、神经退行性疾病和癌症等多种疾病的重要诱因。现有的PA探针在其探针设计中主要利用ONOO^-的强氧化性质。例如，在ONOO^-存在下，苯基硼酸酯可以水解为苯酚，激活PA发射体的ICT效应，从而激活更长波长的PA信号。然而需要注意的是，该过程也可能受到H₂O₂的干扰。为了实现对ONOO^-的特异性响应，Pu等人提出了一种空间位阻硼烷掺杂方法来构建可活化的纳米PA探针。作者首先使用aza-BODIPY作为PA发色团、甲基苯基硼酸频哪醇酯作为响应基团创建了传感组件BBD，然后通过两亲性三嵌段共聚物PEG-b-PPG-b-PEG将其与三苯基硼烷包封，得到比率型纳米探针OSN-B1。在ONOO^-响应后，BBD的硼酸酯部分迅速氧化和裂解，引起从675 nm到745 nm的红移。三苯基硼烷作为保护层，可被ONOO^-降解，同时对其他ROS保持惰性，并提供pH缓冲环境以维持稳定的PA比率信号。OSN-B1可用于小鼠皮下肿瘤内ONOO^-的PA成像。抗氧化剂药物（NAC）治疗组和未治疗组在680 nm处的PA增量信号均显著增加。随着时间的推移，未治疗组小鼠的PA ₇₅₀/PA ₆₈₀比值逐渐增加并达到最大值，是NAC治疗组小鼠的2.6倍，这些数据验证了肿瘤中ONOO^-对纳米探针的选择性激活，并突出了其在药物治疗后实时监测ONOO^-水平的能力。ONOO^-可以氧化CQC中带有吸电子基团的不饱和双键，导致相应的醛或酮断裂，破坏发色团的共轭结构，使其吸收波长发生红移，Zhou等人在aza-BODIPY的2位引入共轭不饱和酮，构建了探针AZB-1该探针在λ_abs＝660 nm处显示出强烈的PA信号。在与ONOO反应时，2-位的共轭双键被氧化成醛，该探针显示出在类风湿性关节炎模型小鼠中ONOO^-的PA成像的潜力。

一氧化碳（CO）的PA探针。

   作为一种代表性的气体信号分子，CO在各种过程中发挥着重要作用，包括细胞保护、信号转导和抗炎功能。病理性CO水平的变化与心血管疾病、败血症和癌症等疾病密切相关，使CO成为这些疾病的潜在早期诊断指标。实现体内病理性CO的动态追踪仍然是PA探针领域的焦点。与其他活性氧或RNS的高反应性相比，CO的反应性较低，导致探针设计的反应机制有限已经开发了各种PA探头，包括MTR-CO、QL-CO、DOPCO和RP-CO。使用不同的半花青或若丹明衍生物作为它们的PA发色团。这些探针在PA发色团中引入烯丙基甲酸酯基团作为保护单元。这些烯丙基甲酸酯基团抑制发色团的ICT效应，有效地将其置于“笼状”状态，从而猝灭其NIR PA信号。在Pd²⁺和CO存在下，Pd ²⁺可被原位还原生成Pd⁰，甲酸烯丙酯基团与Pd⁰发生Tsuji-Trost反应生成Pd-π-烯丙基配合物，导致甲酸烯丙酯基团脱保护，释放出半花青或罗丹明，并且恢复700 nm附近的PA信号。这种PA信号增强允许这些探针在各种炎症小鼠模型中实现PA检测和CO成像。例如，MTR-CO在LP诱导的气囊炎症小鼠模型中成功地进行了炎症部位CO的PA成像，信号增强了约3.2倍。QL-CO在LPS诱导的皮下炎症模型小鼠中表现出优异的成像能力，通过730 nm处PA信号的增加指示炎症病变的位置和程度。DOP-CO和RP-CO通过735 nm和670 nm的双通道比值成像实现了APAP诱导的急性肝损伤及后续药物治疗过程中CO水平的动态成像，这些结果强调了这些探针用于CO精确成像的应用潜力。Kim及其同事开发了一种CO PA探针NO₂-BODIPY，利用一种策略，该策略涉及通过PeT和ICT的合作机制将硝基还原为氨基。在激发态下，BODIPY对硝基苯部分的PeT效应减弱了BODIPY的PA信号。然而，当硝基被CO还原为氨基时，PeT过程被抑制。这不仅增强了BODIPY在700 nm处的PA信号，而且还增强了ICT效应，导致NH₂-BODIPY在760 nm处出现新的吸收峰。通过监测700 nm和760 nm处的PA信号比率，NO₂-BODIPY能够动态跟踪细菌性肺炎小鼠肺部的CO水平，证明了其在细菌性肺炎应用中精确成像的潜力。

缺氧PA探针

   缺氧微环境的特征是局部组织或细胞区域的氧分压（pO 2）显著降低，与肿瘤、缺血性疾病和慢性炎症等疾病密切相关。因此，体内缺氧的快速特异性检测具有重要的科学和临床意义。目前的临床方法依赖于吸收的差异，专门设计用于响应缺氧的小分子PA探针的开发预计将为缺氧微环境成像提供更通用的选择。构建小分子PA探针的主要策略涉及通过还原酶还原二甲基N-氧化物或硝基（例如细胞色素P450（CYP 450）和硝基还原酶（NTR））以形成二甲基氨基。在这个过程中，二甲基N-氧化物或硝基通常用作与电子-N-氧化物共轭的给电子前体，吸电子基团。由于它们强的吸电子特性，探针的ICT效应被抑制，主要表现出固有吸收。在二甲基N-氧化物或硝基还原为二甲基氨基时，探针形成推拉电子结构，增强ICT效应，导致吸收峰的红移和相应PA信号的激活。Chan等合成了三种缺氧探针HyP-1、rHyP-1和CRaB-HyP，它们是通过用4-二乙基氨基-N-氧化苯基（4-diethylamino-N-oxyphenyl）作为反应基团修饰aza-BODIPY的3位而得到的。通过调节5-位芳环的供电子能力及其与aza-BODIPY核的共面性来调节吸收波长和摩尔消光系数。在缺氧条件下，N-氧化物转化为苯胺，由于增强的ICT效应导致实验室的红移，从而实现对缺氧的比率响应。与HyP-1相比，rHyP-1由于其更强的ICT效应而表现出更大的红移; CRaB-HyP具有改善的平面性，显示出增强的摩尔吸光系数和上级PA响应性。这些探针在4 T1荷瘤小鼠和后肢缺血模型中表现出优异的体内成像能力，在肿瘤和缺血组织中，HyP-1在770 nm处的PA信号分别增加约20.5倍和3.1倍在肿瘤组织中，rHyP-1使PA ₈₂₀/PA ₇₅₀比率增加约1.2倍，从而允许在肿瘤内不同深度处高分辨率检测PA信号。

硫化氢（H₂S）的PA探针

   H₂S是一种重要的气体信号分子，在各种生理过程中发挥关键作用，包括调节血管舒张、神经传递和免疫反应。其抗氧化特性可有效保护细胞免受氧化应激损伤。然而，H₂S的过量产生可导致炎症反应和细胞损伤，此外，高浓度的H₂S对细胞表现出显著的毒性，破坏正常的细胞功能。因此，开发用于体内H₂S水平动态检测和成像的PA探针至关重要。H₂S是一种典型的反应性硫物种（RSS），具有很高的反应活性，因此，H₂S PA探针的特异性响应设计往往利用其强的亲核性和还原性，代表性反应包括H2S对卤代芳烃和2，4-二硝基苯基醚的亲核取代反应，以及H₂S还原芳基叠氮化物这些反应通常产生具有较强供电子能力的产物，如芳基硫醇、酚氧离子和芳基胺，与原始反应物相比，ICT效应增强。因此，吸收波长向更长波长移动，从而实现双波长比率PA响应。

   Zhao等人通过在混合PA发色团中BODIPY部分的3位引入氯原子构建了探针BODPA。该探针通过氯原子的亲核取代反应H₂S，产生具有更强ICT效应的硫醇取代分子BOD-HS，导致PA信号在780 nm处随H₂S浓度的增加而线性增加。通过将BODPA包封在核-壳二氧化硅纳米复合材料的疏水核内，由于肿瘤中胱硫醚-b-合酶（CBS）的过表达导致过量的H₂S产生，在HCT116荷瘤小鼠中，Si@BODPA被升高的H₂S水平激活，而其PA信号在CBS抑制剂氨氧基乙酸（AOAA）的存在下被显著抑制，证实了探针对H₂S的准确响应。Fan等人发现，花青染料（CyCl-1）可通过其中间氯原子的亲核取代实现对H₂S的PA响应。在此过程中，800 nm附近的最大吸收逐渐降低，而720 nm附近的吸收峰不断增加，导致A₇₂₀/A₈₀₀比率增加约122.5倍XyCl-1可以基于PA信号在720 nm和800 nm处的变化对小鼠中的外源性和内源性H₂S水平进行比率PA成像。

生物硫醇的PA探针生物硫醇

   生物硫醇，包括GSH、半胱氨酸（Cys）和同型半胱氨酸（Hcy），在各种生理和病理过程中起着至关重要的作用，如氧化还原平衡、蛋白质结构和功能、代谢和解毒。生物硫醇的异常浓度与一系列疾病密切相关，包括心血管疾病、神经退行性疾病、肝功能衰竭、癌症。因此，开发具有临床诊断潜力的生物硫醇PA探针对于监测和准确测量硫醇水平至关重要，这对于了解它们在生物系统中的功能以及诊断和治疗相关疾病至关重要。实现对不同类型生物硫醇的特异性响应是PA探针设计和合成的关键。与先前报道的小分子荧光探针类似，PA探针对生物硫醇的选择性识别利用其独特的反应性，例如还原和亲核性质，与特定基团反应。例如，GSH可通过还原二硫键或亲核取代苯基硒醚和2，4-二硝基苯基磺酸酯（DNS）而被特异性检测，Cys可选择性地与含有a，b-不饱和双键的丙烯酸芳酯加成，从七元内酰胺环释放酚羟基。利用GSH选择性还原二硫键是GSH探针设计中的常用策略，Fan等人通过引入2-IR 806.130中位的（2-氨乙基）二硫代）吡啶遇到GSH时，二硫键被还原，释放出2-氨乙基硫醇。由于硫醇的强亲核性，2-氨乙基硫醇可进一步发生分子内亲核取代反应，生成硫醇取代产物IR 806-S-NH 2。该过程伴随着PA信号在680 nm处减弱，在820 nm处出现信号，IR 806-PDA在水溶液中通过自组装形成均匀的纳米粒子，促进局部浓度相对较高的肿瘤区域的被动积累，以增强PA亮度。在皮下HeLa异种移植肿瘤模型中的GSH成像中的PDA纳米探针显示，探针通过增强的渗透性和保留（EPR）效应在肿瘤部位累积，其中PA₈₂₀/PA₆₈₀比率增加约2.94倍。

   Liu等人通过在三氰基呋喃衍生的花青染料的中间位置引入苯基硒化物作为GSH响应基团构建了探针MC-PSE。由于探针的疏水性，它可以在水溶液中自组装形成在1000 nm处具有强吸收的J-聚集体。与GSH反应后，苯基硒化物被取代，增加了所得单体MC-G的水溶性，导致J-聚集体分解成单体，具有从1000 nm至900 nm的蓝移。因此，该探针可以通过监测1000 nm和900 nm处PA信号的变化来实现对GSH的比率响应。在皮下HCT-116肿瘤小鼠模型中，探针被GSH激活，其中PA₉₀₀/PA₉₈₀ nm比率在肿瘤组织中增加约2倍，而在正常组织中显示最小变化，证明其用于体内比率成像的能力。

酶的PA探针

   酶作为生物系统中的催化剂，参与生物体内的各种化学反应，在几乎所有生物过程中发挥关键作用，包括新陈代谢、解毒、DNA复制、肌肉和神经功能、信号转导和细胞凋亡。酶水平或活性异常可能表明潜在的健康问题。开发能够在体内检测和成像酶的PA探针有望为生理学和病理学研究、早期疾病诊断和药物开发提供重要的研究工具。大多数报道的酶响应性PA探针都是以氧杂蒽杂交的半花菁或罗丹明为PA发色团设计的，这些探针通常含有特定的酶可水解基团，这些基团连接在氧杂蒽单元6位的羟基或胺上，在它们的非活性状态下，这些连接的基团抑制发色团的ICT效应，引起蓝移，导致猝灭或“关闭"NIR PA信号。在被靶酶特异性水解后，发色团的NIR吸收恢复，考虑到商业PA成像系统中对NIR激发的常见要求，这些探针被设计成通过这种增强的NIR PA信号实现酶检测和体内成像。

碱性磷酸酶（ALP）的PA探针

   ALP催化磷酸酯的水解，释放无机磷酸盐，并参与生理过程，如骨矿化、营养转运、神经递质合成和解毒。ALP水平升高与各种疾病有关，包括骨骼疾病、肝脏和胆道疾病、骨肉瘤和前列腺癌。ALP的准确体内成像对于研究其生理和病理功能至关重要。为了实现这一目标，Lin等人通过将ALP响应性磷酸基团并入半花菁染料中来开发探针LET-3，使得能够对肿瘤组织中的ALP进行PA成像。在ALP存在的情况下，磷酸基团被特异性地裂解，该转化导致吸收峰向700- 700 nm的红移。在荷瘤小鼠中，用LET-3处理导致710 nm处的PA信号显著增加，比对照组高约9.75倍，清楚地表明其用于响应肿瘤组织中ALP过表达的效用。Liang及其同事使用ALP激活的自组装策略设计了一种NIR探针IR775-PhePhe-Tyr（H₂PO₃）-OH（1P），其特征在于Cy7作为PA发色团和磷酸化肽（Phe-Phe-Tyr（H₂PO₃）-OH）作为ALP反应基团，在ALP催化下，1P有效地转化为IR775-Phe-Phe-Tyr-OH，其随后自组装成纳米颗粒（1-NPs）。这些1-NPs的形成激活795 nm处的PA信号，将探针原位注射到HeLa肿瘤模型小鼠中显示出在肿瘤部位显著增强的PA信号，这证明了探针对浅表癌组织中ALP过表达成像的高灵敏度。

b-半乳糖苷酶（b-gal）的PA探针

   β-gal是乳糖消化和能量代谢的关键酶，被认为是癌症和衰老的标志物。准确体内检测β-gal对于癌症和衰老研究具有临床意义。β-gal选择性水解β-半乳糖苷是探针设计中广泛使用的机制。例如，通过将β-半乳糖苷掺入不同的半花菁染料中，开发了两种β-半乳糖应答PA探针CyGal-P和LGAL。这两种探针在响应于β-gal时分别在688 nm和730 nm处激活PA信号，并且对该酶表现出优异的体内成像能力。促进从单核吞噬细胞系统（MPS）逃逸并促进肾清除。CyGal-P在SKOV3皮下肿瘤模型小鼠的肿瘤区域有效地积聚，并且对SKOV3细胞中过表达的β-gal有反应，活化的CyGal-P也表现出光热消融肿瘤。用LGAL研究了肿瘤治疗过程中小鼠体内血管和组织的衰老过程与β-gal水平的关系，腹腔注射后，20周龄小鼠的PA信号强度显著增加，是4周龄小鼠的2.41倍。在肿瘤衰老实验中，LGAL在顺铂治疗的肿瘤组织中显示出增强的PA信号，表明在顺铂刺激下β-gal水平增加。

醌氧化还原酶1（hNQO1）的PA探针

   hNQO1是一种多功能酶，在细胞保护、抗氧化活性和各种疾病（特别是癌症）的发展中起关键作用。其在恶性细胞中的过度表达使其成为有价值的生物标志物和诊断和治疗干预的潜在靶点。使用甲氧基化醌丙酸/酰胺作为经典的hNQO1响应基团是探针设计中值得注意的策略。当醌结构被hNQO1还原为苯酚时，产生的酚羟基与羰基碳发生分子内亲核加成，基于这种反应机制，三种不同的hNQO1 PA探针，Rhodol-PA，RX 3，和TPA-X-Q，是通过将甲氧基化醌丙酸/酰胺引入罗丹明和半花菁平台的供电子末端而开发的。这些探针可以通过被hNQO1还原来激活700 nm附近的NIR PA信号，使hNQO1在体内PA成像成为可能。Rhodol-PA的成像能力在HT-29细胞中得到了验证，与MDA-MB-231细胞相比，PA信号增强了约8倍，与HT-29细胞中更高的hNQO1表达的报道一致。尾静脉注射后HT-29肿瘤组织中探针的PA信号约为MDA-MB-231肿瘤组织中的7倍，证实Rhodol-PA对hNQO1过表达的特异性。

   在大肠杆菌胃肠炎模型中，RX 3探针显示出更高的PA信号（3.0倍），表明其通过高hNQO1表达早期诊断细菌性胃肠炎的潜力。TPA-X-Q在乳腺癌小鼠模型的肿瘤病变中显示出优异的PA成像能力，通过高对比度增强准确定位肿瘤并阐明hNQO1的空间分布。

用于亮氨酸氨肽酶（LAP）的PA探针

   LAP是一种催化肽或蛋白质中亮氨酸残基水解的酶，与肝功能密切相关。肝损伤和肝炎等疾病通常会导致LAP活性升高，使其成为药物性肝损伤的诊断生物标志物。为了能够动态体内检测LAP，Wu等人构建了探针DLP。他们通过4-氨基苄基连接子将N-末端亮氨酰分子连接到半花青发色团上来实现这一点。允许酶的体内检测。（对乙酰氨基酚）诱导的肝损伤模型中，DLP在肝脏中表现出与正常小鼠相比显著更高的PA信号。探针通过增强的PA信号精确地定位腹腔内的肝损伤，使得能够在肝损伤过程中对肝脏水平进行时空动态成像。

尿激酶型纤溶酶原激活物（uPA）的PA探针

   尿激酶型纤溶酶原激活物（uPA）是一种丝氨酸蛋白酶，在组织重塑、细胞迁移和纤维蛋白溶解中发挥核心作用。肿瘤中高水平的uPA与各种癌症（包括乳腺癌、肺癌和前列腺癌）的预后不良和转移风险增加相关。因此，uPA被认为是肿瘤检测的生物标志物和抗癌治疗的新靶点，Pu等人利用半花青（CyN₃OH）与肽链结合构建了探针P-Dex（Cbz-Gly-Gly-Arg-OH）。葡聚糖的存在增强了探针的水溶性，并允许快速的肾清除，P-Dex选择性响应uPA，导致695 nm处PA信号增强。在侵袭性MDA-MB-231乳腺癌细胞或活肿瘤组织中，探针特异性响应过表达的uPA，而在非侵袭性MCF-7乳腺癌细胞中由于uPA表达较低而显示出最小的变化。此外，在用uPA抑制剂4-CPG预处理的模型小鼠中，探针的PA信号显著降低，表明其特异性检测恶性肿瘤的能力。

单酰基甘油脂酶（MGL）和脂肪酸酰胺水解酶（FAAH）的PA探针

   MGL和FAAH是内源性信号分子大麻素降解的关键酶，在调节内源性大麻素相关信号转导、癌症、炎症、中枢神经系统疾病和代谢调节中发挥关键作用。Chan等人设计了两种探针，这些探针分别利用花生四烯酸和花生四烯酸酰胺作为MGL和FAAH的特异性反应基团。在被其相应的酶激活后，在740 nm处发生PA信号的显著增强。在肥胖相关的肠道炎症模型中，PA-HD-MGL和PA-HD-FAAH成功实现了MGL和FAAH的体内成像。注射这些探针的模型小鼠的3D PA成像显示，高脂肪组中的PA信号强度是低脂肪组的1.74倍，该结果清楚地表明，这些探针可以有效地监测细胞凋亡的上调。肥胖动物胃肠道炎症中的MGL活性。

人中性粒细胞弹性蛋白酶（HNE）的PA探针

   HNE是一种重要的丝氨酸蛋白酶，对免疫防御和组织重塑至关重要。HNE在蛋白质降解、先天免疫和炎症中起关键作用。HNE体内平衡的失衡与各种疾病的发展密切相关，使其成为治疗干预的重要靶点。因此，HNE在体PA动态显像对HNE相关疾病的早期诊断和治疗至关重要，为了实现HNE在体PA显像，我们研制了两种PA探针LET-8和NEP3，是通过将2，2，3，3，3-五氟丙酰胺作为HNE的响应基团掺入半花青和罗丹明PA发色团而开发的。在皮下A549肿瘤小鼠模型中，LET-8在700 nm处的PA信号在肿瘤组织中显著增强，达到西维来司治疗组的约3倍。这种增强表明NE水平升高有效激活。NEP3具有被动炎症靶向能力，允许通过670 nm和720 nm的双波长信号对发炎组织中的NE活性进行比率PA成像。在急性肺损伤的BALB/c小鼠模型中，LPS诱导的炎症导致大量NE产生，其将NEP3转化为NEP3-NH₂，从而激活PA信号。与用NE抑制剂西维来司他预处理的小鼠相比，未处理小鼠的炎症区域中的比率PA信号高约5倍，证实了探针对体内内源性NE活性的高灵敏度。

组织蛋白酶B（CatB）的PA探针

   CatB是一种广泛表达的溶酶体半胱氨酸蛋白酶，有助于蛋白质降解并维持细胞内稳态。此外，CatB可存在于细胞外间隙，参与细胞外基质成分（如胶原蛋白和弹性蛋白）的重塑。在动脉粥样硬化中，CatB的高表达可通过蛋白质降解损害易损斑块的结构完整性，导致斑块破裂。此外，CatB通常在各种癌症中上调，并有助于肿瘤进展、侵袭和转移。因此，CatB的动态检测对于心血管疾病和癌症的临床诊断具有重要意义。

   Zhang等人报道了一种PA探针L-CRP，适用于CatB的精确体内成像。该探针由可被CatB特异性水解的二肽Val-Cit和含有亲脂基团的半花青发色团组成。当L-CRP的二肽反应基团被CatB裂解时，它释放HD-烷基，在695 nm处激活PA信号。体内成像结果表明，该探针在模型小鼠动脉粥样硬化斑块中可被CatB激活，揭示硬化程度; L-CRP主动脉区PA信号与斑块易损性之间观察到良好的相关性;动脉粥样硬化小鼠PA和荧光成像结果表明，由于较好的组织穿透深度，PA成像的准确性超过荧光成像，人体组织动脉粥样硬化斑块的成像结果进一步证明了其良好的响应性，LCRP孵育后斑块中的PA信号比正常血管增加了3.27倍，这表明L-CRP可以在人体组织内的斑块中表现出CatB的活化信号。

用于γ-谷氨酰转移酶（GGT）的PA探针

   GGT是一种广泛存在于各种组织中的酶，在肝脏中的浓度最高。它在GSH代谢中起着至关重要的作用，并参与调节氧化应激稳态。GGT水平升高与代谢综合征、糖尿病和肝损伤有关。因此，开发用于动态监测GGT水平的PA探针有助于肝脏疾病的早期诊断。将γ-谷氨酰分别引入到罗丹明和半花菁平台上，制备了两种GGT敏感的PA探针NIR-GGT和CySO₃-GGT，这两种探针中的γ-谷氨酰可被GGT选择性切割，从而激活相应的胺取代罗丹明（NIR-NH₂）或酞菁（CySO₃-NH₂），从而增强PA信号。NIR-GGT可以动态监测APAP诱导的急性肝损伤期间肝脏中GGT水平的升高和NAC治疗期间的降低CySO₃-GGT允许肝细胞癌（HCC）发展过程中不同阶段的PA成像。值得注意的是，CySO₃-GGT有效地使肿瘤和正常组织之间的边界可视化，这些研究结果突出了GGT响应PA探针用于诊断和监测肝脏疾病的显著潜力。

pH敏感PA探针

   pH的精确控制在许多生物学事件中起着至关重要的作用，包括细胞生长、离子转运、细胞粘附和酶活性调节。不仅细胞内细胞器需要维持适合每个过程的特定pH水平，细胞外pH也很重要。在小分子PA探针的设计中，一种常见的策略是利用PA生色团的质子化或去质子化来抑制或增强其ICT效应，从而导致PA信号的变化Lin等人通过在IR1061的中位引入烷基胺构建了pH响应探针IR-pH。156当pH从3增加到7时，发生去质子化，抑制ICT效应并导致在808 nm处的吸收波长降低，从而淬灭PA信号。为了提高水溶性和稳定性，通过与DSPE-PEG₂₀₀₀共沉淀制备IR-pH作为纳米探针LET-4。通过口服给药，LET-4能够通过808 nm处PA信号的变化实时成像小鼠胃酸水平的动态变化。Tang等人开发了探针CPH，使用Cy5作为PA发色团，苯基磺酰胺作为响应基团。在酸性条件下，磺酰胺的质子化导致吸收波长的浅色偏移，峰值从800 nm偏移至610 nm。此外，A₆₁₀/A₈₀₀比值在pH 5.9至7.7范围内显示出线性增强。该探针通过监测PA信号比值的变化，使炎症小鼠和黑素瘤小鼠的酸度可视化。在LPS诱导的小鼠模型中，腹腔注射CPH导致LPS刺激侧的800 nm处的PA信号显著强于注射生理盐水侧，PA₆₁₀/PA₈₀₀比值降低，表明LPS刺激位点处的弱酸性环境。

极性响应PA探针

   极性在塑造生物系统内分子的结构、功能和相互作用方面起着至关重要的作用。在病理环境中，蛋白质的错误折叠或其浓度的变化可导致极性变化，从而可能诱发各种疾病。一种极性响应PA探针，ER-P，是基于半花青-BF₂复合物杂合体开发的，其特异性靶向肝损伤期间的内质网（ER）极性变化。由于其固有的ICT效应，ER-P的实验室随着极性的增加而显著红移，跨越从600 nm到850 nm的宽范围。在两个选定的波长，700 nm（PA₇₀₀）和800 nm（PA₈₀₀）的PA信号的强度比，线性增加的介电常数的降低，突出了探针的潜在体内极性响应。ER-P通过与磺酰胺受体结合在内质网中积累，使得能够在糖尿病模型小鼠的疾病过程中可视化肝脏的极性变化。在用链脲佐菌素诱导糖尿病期间，小鼠的肝脏极性增加，介电常数从18.4上升到55.2。这种变化导致PA在700 nm处的强度逐渐降低，同时伴随着800 nm处的信号增加，导致PA₇₀₀/PA₈₀₀比值从3.3降低到0.91。在用糖尿病药物二甲双胍治疗后，肝脏极性降低，PA比率恢复到基线水平。这些结果证明了ER-P用于深部肝组织极性变化的动态成像的潜力。

结论

   目前，已经开发了各种具有代表性的PA探针分子平台，使关键生物分子的初步体内时空映射和病理关联成为可能。该领域的未来发展仍面临着一些关键挑战。

光声性能的精确调制

   目前大多数PA探针构建在经典的荧光染料支架上，这些支架通常同时显示出强荧光和中等PA特性，使得它们适合于双模态荧光/PA成像。然而，荧光和PA信号分别来源于辐射和非辐射衰变途径，呈现出固有的生物物理权衡。虽然开创性的努力，例如罗奇福德等人的那些，虽然已经为理解结构-PA性能关系奠定了基础，但通过分子工程精确调节PA转化效率的系统策略仍然有限，迫切需要深入的理论指导，以实现探针活化前后的高PA性能。

新型分子平台的开发

   为了最大限度地提高穿透深度并最大限度地减少内源性发色团的干扰，PA成像有利于在生物光学窗口（尤其是NIR和SWIR区域）中具有强吸收和高PA转换效率的探针。研究表明，与传统的NIR波长相比，短红外光（如1064nm、1208nm）提供更深的组织穿透和减少的背景信号。然而，大多数有机染料的共轭长度相对较短，除了某些七甲川菁和少数BODIPY衍生物外，大多数经典染料的最大吸收（例如，半花青、恶嗪）通常限于约700 nm。许多现有的探针在700 nm附近显示出PA信号增强，但不能满足光谱分离要求（约50 nm）因此，开发在近红外（特别是短波红外）区域具有强吸收和优异PA性能的分子平台是一个关键目标。

比率探头的设计

       来自内源性发色团的背景信号和探针浓度的变化是精确PA成像的主要障碍。比率测量策略提供了可以克服这些问题的内部校准。然而，这样的设计需要一个大的光谱偏移（通常＞50 nm）激活时，以避免成像通道之间的信号串扰。实现这一点的染料具有窄吸收峰和小的带隙，特别是那些在短波红外区域的工作仍然是一个重大的技术挑战。

克服生物屏障，提高靶向效率

   在生物系统中进行有效的PA成像要求小分子探针具有良好的生物相容性、屏障穿透能力和组织/器官特异性靶向。对于脑等病理区域的成像，探针必须能够穿过BBB。设计同时满足分子大小、水溶性、近红外吸收、并且BBB渗透的功能化能力是高度复杂的，并且仍然是重大的合成挑战。

与先进的化学生物学工具集成

   尽管PA探针在疾病相关的体内成像方面取得了令人印象深刻的进展，但大多数研究仍然集中在动物模型中检测关键生物分子。未来的发展应寻求整合先进技术，如超分辨率荧光成像，生物正交化学，蛋白质组学，翻译后修饰分析，这种跨学科的融合将有助于扩大PA探针在分子水平上破译关键生物学过程和疾病机制的效用。

仪器和成像技术

   PA探头的发展也受到当前PA成像系统的局限性的限制。商业PA仪器通常是昂贵的，并且仍处于临床和临床前应用的开发中。许多商业系统的成像深度通常限于约2 cm，这福尔斯达不到临床深部组织成像的需要。此外，数据采集和图像重建的时间密集性质目前阻碍了使用高分辨率3D PA技术的动态成像。

参考文献

Small-molecule photoacoustic probes for in vivo imaging, Xiaoqing Wang, Zhipeng Liu, Beibei Cui, * QianSun, Hang Liu, Zhipeng Liu*, Chem. Soc. Rev., DOI: 10.1039/d5cs00745c