内容提要
本研究通过系统分析已报道的有机光敏剂（PSs），提出在保持适当偶极矩的前提下提高氢键比例的设计原则，并据此成功制备了相应的纳米单晶（NSCs）。基于此，我们设计出D-A+-D型DTZP-PF6−化合物，采用晶种介导策略制备出高质量的DTZP-PF6−纳米单晶。通过三维电子衍射（3D-ED）表征发现，该纳米单晶呈现滑移角为66.93°的H型分子排列方式，这与溶剂挥发法制备的常规微米级DTZP-PF6−晶体的堆积模式存在显著差异。得益于其无缺陷的晶体结构和高效的电荷分离特性，DTZP-PF6−纳米单晶表现出优异的I型活性氧生成能力，而其对应的非晶态纳米颗粒则以II型活性氧生成为主。这种特性可在常氧和缺氧条件下通过线粒体氧化应激有效诱导细胞焦亡和免疫原性细胞死亡，从而显著增强活性氧介导的光免疫治疗效果。
实验结果与讨论
光敏剂的理性设计用于制备神经干细胞
为确立有机纳米单晶的设计原则，本研究收集了若干已报道的具有扭曲三苯胺（TPA）或四苯乙烯（TPE）结构的有机光敏剂。根据对称性和电荷特性，这些分子被分为四类：D-A-D型、D-A+-D型、D-A型和D-A+型。作为自然界普遍存在的非共价相互作用，氢键（H键）具有可调控性、多价性和方向性特征，能轻易形成从纳米尺度到宏观尺度的交联规则网络。基于此，后续研究将氢键作为光敏剂纳米单晶化的主要驱动力，为后续成核与结晶提供先决条件。基于上述规则简化化学结构后，我们设计了对称型D-A+-D光敏剂DTZP-PF6：以两个TPA基团作为扭曲电子给体(D)，阳离子噻唑基团作为共轭电子受体(A)。为深入理解分子间氢键，我们还将抗衡离子替换为碘离子(I−)、氟离子(F−)和四氟硼酸根(BF4−)，分别命名为DTZP-I−、DTZP-F−和DTZP-BF4−。光学性质测试显示：这些分子在DMSO溶液中均具强吸收能力，固态发射显著。其中DTZP-PF6−在DMSO/水混合体系中呈现~730 nm红移发射峰，AIE指数(αAIE)高达55.5。单晶结构分析表明：阳离子噻唑基团导致分子扭曲，这种构象同时影响HOMO/LUMO电子云分布。值得注意的是，DTZP-PF6−的二聚体堆积距离达4.346 Å，能有效避免π-π堆积导致的荧光淬灭。
DTZP-PF6−纳米结构复合物的制备与结晶机制
我们通过简单的纳米沉淀法制备了DTZP-I−、DTZP-F−、DTZP-BF4−和DTZP-PF6−的纳米晶体。通过增强分子间作用力，DTZP-PF6−体系能获得高质量晶体——相较于其他三种体系，该晶体检测到更强烈的衍射斑点和信号。这进一步证实了我们提出的设计原则可应用于具有可靠结晶性能的D-A+-D型有机光敏剂。但值得注意的是，尽管纳米晶体具有潜力，高能垒和缓慢的成核速率仍导致多晶结构的形成。因此，仍需通过DTZP-PF6−制备具有改善结晶性和减少缺陷的纳米结构晶体。在制备纳米单晶（NSCs）过程中，克服成核过程相关的能量壁垒具有挑战性，随后还存在成核位点不确定性和结构紊乱问题，从而导致多晶结构形成。因此，本研究采用晶种介导策略基于DTZP-PF6−制备NSCs，即先获取微米级晶种，再将其注入含有DTZP-PF6−纳米颗粒的水溶液中进行超声处理。为优化晶种质量，我们调节了含DTZP-PF6−的水与THF混合溶液的体积比（fw）从60%至90%。只有当fw为80%时才能获得规则长方体结构的DTZP-PF6−晶种（DTZP-PF6− CSs）（5μm×2μm），其他条件下仅能得到无定形纳米球。该结果与AIE曲线的拐点相吻合，表明聚集体形成。通过TEM观察到的DTZP-PF6− CSs结晶过程显示，其形貌经历了从球状到针状，最终形成长方体的明显演变。该结晶过程遵循液-液相分离（LLPS）介导的自组装机制，包括富溶剂前驱体形成、初始晶核生成、有序分子堆积及形貌演化等步骤。将制得的DTZP-PF6− CSs加入含DTZP-PF6−纳米颗粒（DTZP-PF6− NPs）溶液后，经超声处理（200W，3分钟）成功制备出粒径均一（约100nm）的DTZP-PF6− NSCs。高分辨TEM（HR-TEM）和选区电子衍射（SAED）图像中清晰的晶格条纹与规则衍射点证实了其单晶特性，元素面分布图也显示F、O、N、S等代表性元素在NSCs中均匀分布。值得注意的是，DTZP-PF6− NSCs在H2O、PBS和DMEM溶液中分散5天后仍能保持单晶特征，其粒径和多分散指数（PDI）在5天内也无明显变化，进一步证实了良好的胶体稳定性和形貌稳定性。由于DTZP-PF6− NSCs是基于DTZP-PF6− CSs制备的，二者应具有相同晶体结构。同步辐射X射线衍射（SXRD）谱图和19F固态核磁共振（19F ssNMR）波谱分析验证了这一推论。两种情况下，除DTZP-PF6−纳米单晶中源自DSPE-PEG2000的特征峰外，无定形DTZP-PF6−粉末的19F固态核磁共振谱仅在-71.63 ppm处显示一个宽峰。值得注意的是，DTZP-PF6−纳米单晶中观察到三个明显峰位，分别位于-69.14 ppm、-70.98 ppm和-72.73 ppm，这与DTZP-PF6−块状单晶的谱图特征高度吻合。这些结果表明PF6−周围差异化的化学环境可能与结晶过程相关，反映了强烈的分子间和分子内相互作用。此外，未添加晶种的体系即使经过10分钟超声处理也未能形成任何纳米单晶，由此证实具有单晶结构的晶种能有效促进DTZP-PF6−纳米单晶的形成。
DTZP-PF6−纳米结构催化剂产生的I型活性氧
我们进一步研究了DTZP-PF6−纳米结构晶体（NSCs）中分子堆积对其活性氧（ROS）生成的影响。作为对照，制备了非晶态DTZP-PF6−纳米颗粒（NPs）。透射电镜分析显示DTZP-PF6− NPs具有均匀的粒径分布，平均直径约70纳米。值得注意的是，DTZP-PF6− NSCs展现出更明亮的近红外一区（NIR-I）发射，其光致发光量子产率（PLQY）达40.3%，显著高于培养的DTZP-PF6− NPs（10.2%）。这可能是由于晶体态中旋转或振动导致的非辐射跃迁过程受到抑制所致。随后采用2',7'-二氯二氢荧光素二乙酸酯（DCFH-DA）评估总ROS生成能力。白光照射8分钟后，DTZP-PF6− NCSs组DCFH荧光强度增强约210倍，表明其高效ROS生成能力。而DTZP-PF6− NPs表现较差。通过氨基苯基荧光素（APF）、二氢罗丹明123（DHR123）和单线态氧传感器绿（SOSG）分别检测羟基自由基（·OH）、超氧阴离子（O2·−）和单线态氧（1O2）时发现：DTZP-PF6− NPs未能引发APF和DHR123的明显荧光增强，而DTZP-PF6− NSCs的信号分别增强2.1倍和4.0倍，表明其更高效的·OH和O2·−生成能力。同时，DTZP-PF6− NSCs中1O2信号增幅可忽略，证实其II型ROS生成受限。电子自旋共振（ESR）谱进一步证实：使用DMPO和TEMP作为自旋捕获剂时，DTZP-PF6− NSCs组出现明显的DMPO−OH·加合物信号，但未检测到TEMP−1O2加合物信号。这表明DTZP-PF6− NSCs倾向于产生I型ROS而抑制II型通路，而NPs表现完全相反。
相同条件下DTZP-PF6− NSCs的光电流信号更强、电荷转移电阻更低，证实其高效电荷分离能力。这表明DTZP-PF6− NSCs中紧密的分子堆积网络形成了更完整的连接点，显著促进电荷传输，从而提升I型ROS生成效率。
DTZP-PF6−纳米载体在肿瘤细胞中的光动力性能表现
研究人员采用DCFH-DA作为总活性氧指示剂、APF作为·OH指示剂、DHE作为O2·−指示剂，在细胞水平考察了DTZP-PF6−纳米超分子复合物（NSCs）产生I型活性氧的特性。经DTZP-PF6− NSCs处理并接受白光照射2分钟后，无论在常氧（21% O2）还是低氧（1% O2）条件下，HeLa细胞均显现出明亮的绿色荧光信号，这表明即便在低氧肿瘤环境中也能高效产生活性氧。值得注意的是，Ce6（II型光敏剂）在低氧环境下无法触发活性氧生成，而DTZP-PF6− NSCs仍保持优异的光动力治疗能力，证实了该复合物具有不依赖高氧环境的光动力治疗效率。此外，在常氧和低氧条件下均观察到APF与DHE的强荧光信号，有力证明了·OH和O2·−的显著生成。通过CCK-8实验评估不同浓度DTZP-PF6− NSCs在常氧（21% O2）与低氧（1% O2）环境白光照射下的半数抑制浓度（IC50）。黑暗条件下DTZP-PF6− NSCs对正常细胞（L929、RAW 264.7和HaCat细胞）的IC50值为26.30−64.75 μM，显示出良好生物相容性；而光照条件下IC50降至3.18∼16.67 μM，表现出显著光毒性。对于HeLa和4T1癌细胞，无论在常氧（IC50 9.32∼17.84 μM）或低氧（IC50 12.40∼15.95 μM）条件下暗毒性较弱，但在光照后常氧（IC50 0.70∼1.85 μM）与低氧（IC50 0.79∼1.44 μM）环境均呈现强光毒性。值得注意的是，尽管氧含量存在差异，两种癌细胞的IC50值却较为接近。通过活死细胞染色实验直观展示光动力治疗效果：光照后红色荧光显著增强而绿色荧光衰减，与初始状态形成鲜明对比。Annexin V-FITC/PI双染的流式细胞术分析进一步证实低氧组细胞出现大规模凋亡。这些结果共同表明DTZP-PF6− NSCs对低氧癌细胞具有显著杀伤潜力。为验证其肿瘤治疗潜力，研究人员构建HeLa细胞三维多细胞肿瘤球体（MCTSs）模型。共聚焦显微镜成像显示DTZP-PF6− NSCs孵育4小时后可渗透至球体核心。光照处理48小时后，完整MCTSs逐渐瓦解，体积缩减超95%，充分证明该复合物在低氧肿瘤微环境中具有高效光疗效果。
细胞焦亡与免疫原性细胞死亡在光免疫治疗中的应用
经DTZP-PF6−纳米梭形复合物（NSCs）处理并在光照下的HeLa和4T1细胞均出现明显气泡状肿胀，这种现象可被双硫仑（DSF，焦亡抑制剂）抑制，其形态特征与LPS/ATP诱导的典型焦亡形态相似。我们随后对潜在机制展开深入研究。共定位分析显示DTZP-PF6− NSCs具有优异的线粒体靶向能力，其分布与商用线粒体染色剂MitoTracker Green（MTG）高度一致，共定位率（CR）达99.62%。但当线粒体膜电位（MMP）被羰基氰化物3-氯苯腙（CCCP）破坏后，DTZP-PF6− NSCs在线粒体内的荧光信号减弱。由此可推断，DTZP-PF6− NSCs因其阳离子噻唑基团带正电（经测定在H2O、PBS和DMEM中的zeta电位分别为7.47 mV、8.18 mV和8.33 mV，）而富集于线粒体。基于此，光照下产生的活性氧（ROS）会迅速破坏线粒体结构。与其他组相比，光照下DTZP-PF6− NSCs处理的HeLa细胞中可见明亮的JC-1单体荧光，表明线粒体膜电位显著丧失。这些发现说明DTZP-PF6− NSCs产生的I型ROS可能通过线粒体氧化应激引发焦亡。随后采用共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）进一步研究线粒体功能障碍。光照20秒后这些细胞出现明显的线粒体肿胀变形，而未经处理的细胞在同等光照条件下未观察到明显结构损伤。我们继而使用受激发射损耗（STED）纳米显微镜以超高分辨率监测线粒体内外膜损伤。在低功率延时STED成像（20秒）过程中，可观察到线粒体嵴形态的显著变化：如白色箭头所示，线粒体最初保持健康的线性结构，随后嵴结构开始破裂，迅速形成内外膜碎片化的肿胀结构。此外在黄色箭头区域还捕捉到哑铃状结构及其后续的裂解转变。这种ROS诱导线粒体结构损伤的原位可视化研究为焦亡动态变化提供了重要依据。
结论
通过增强氢键相互作用并平衡光敏剂（PSs）中的偶极矩，我们成功制备了阳离子型DTZP-PF6−，并采用种子介导策略获得其纳米超结构晶体（NSCs）。三维电子衍射（3D-ED）结构分析显示，DTZP-PF6− NSCs呈现66.93°滑移角的H型分子排列，这与培养获得的DTZP-PF6−晶体堆积模式存在显著差异。进一步研究表明，DTZP-PF6− NSCs展现出更高效的电荷分离与转移能力，从而促进I型途径活性氧（ROS）生成。该特性使其在缺氧肿瘤微环境中表现出优于对应非晶纳米颗粒的性能（后者主要产生II型ROS）。此外，通过诱导线粒体严重结构损伤，DTZP-PF6− NSCs能通过诱导细胞焦亡和免疫原性细胞死亡（ICD）实现高效肿瘤细胞消融，最终增强对4T1乳腺癌的抗肿瘤免疫。
参考文献
Cationic Nano Single Crystals: From In Situ Structural Determination to Synergistic Photoimmunotherapy, Peijuan Zhang, Qifei Shen, Diming Xu, Jianye Yang, Xuwei Luo, Pei Zhou, Jiahui Wang, Yanzi Xu, Lingjie Meng, and Dongfeng Dang, J. Am. Chem. Soc. 2025, 147, 41973−41987. https://doi.org/10.1021/jacs.5c15153.
