内容提要
本研究中性能最优的探针为磺基花菁 5 - 溴（Sulfo-Cy5-Br），其结构包含一个花菁 5（Cy5）荧光团，并偶联了两个磺酸基团和一个中心溴原子。其中，具有反应活性的溴基团可通过与蛋白质中的氨基或巯基发生亲核取代反应，实现与蛋白质的共价结合，从而确保探针与质膜蛋白的稳定结合。两个带负电的磺酸基团的引入，不仅使探针在标记过程中具备优异的水溶性和细胞膜不透性，还能借助静电作用与质膜蛋白上部分质子化的氨基相互结合。此外，该探针可通过标记转移实现对质膜损伤的检测，进而在长期细胞事件中实时评估质膜的损伤状态。
实验结果与讨论
Sulfo-Cy5 类染料的分子设计、合成及光物理性质
本研究中探针的设计，核心是利用花菁 5 母核中心亚甲基上卤素的反应活性，使其与氨基、巯基等亲核基团发生反应。荧光团花菁 5 可通过亲核取代反应与质膜表面的全部膜蛋白实现共价结合，从而完成对哺乳动物细胞质膜的永久性标记。探针结构中引入的两个磺酸基团，可确保其细胞膜不透性，避免常规染色过程中探针的非特异性内吞。此外，这些带负电的磺酸基团可通过与膜表面蛋白上质子化氨基的静电作用，促进探针分子向膜蛋白的靠近，进而推动探针与膜蛋白的共价结合。为评估卤代花菁 5 探针的反应活性，本研究设计并合成了 Sulfo-Cy5-Cl、Sulfo-Cy5-Br，同时以 Sulfo-Cy5-H 作为参照。辛醇 / 水体系中的分布实验用于评估探针的亲水性。三种探针均主要分布于水相，表明两个磺酸基团的引入显著提升了其水溶性，这一特性有利于在水溶液体系中实现高效的染色与共价标记。在 450~800 nm 波长范围内，Sulfo-Cy5-H、Sulfo-Cy5-Cl 及 Sulfo-Cy5-Br 的吸收峰均集中在 640 nm 处，与其水溶液呈现的蓝色外观一致。经紫外光激发后，其水溶液可产生肉眼可见的强红色荧光；发射光谱显示，三种探针的发射峰均位于 670 nm，发射波段覆盖 620~780 nm，证实其具备近红外（NIR）发射特性。
Sulfo-Cy5 探针与含氨基 / 巯基小分子及牛血清白蛋白（BSA）的共价反应
为验证 Sulfo-Cy5-Cl 和 Sulfo-Cy5-Br 对蛋白质中氨基、巯基的反应活性，本研究首先以 4 - 硝基苯硫酚和 4 - 硝基苯胺为模型化合物，评估探针的标记动力学与效率。当探针与 4 - 硝基苯硫酚或 4 - 硝基苯胺反应后，产物会因光诱导电子转移（PET）效应发生荧光猝灭，因此可通过检测不同反应时间下的荧光猝灭比例，在生理条件下对反应效率进行定量分析。通过进一步证实，在 4 - 硝基苯硫酚或 4 - 硝基苯胺存在时，探针荧光会发生猝灭；室温水溶液中的反应动力学）显示，0~90 分钟内，Sulfo-Cy5-Cl 和 Sulfo-Cy5-Br 的荧光均随时间逐渐降低，说明两种探针均可在温和条件下与含氨基 / 巯基的分子发生反应。反应动力学数据还表明，Sulfo-Cy5-Br 对 4 - 硝基苯硫酚和 4 - 硝基苯胺的反应活性显著高于 Sulfo-Cy5-Cl：Sulfo-Cy5-Br 与 4 - 硝基苯胺、4 - 硝基苯硫酚的反应收率分别高达 84.4% 和 66.7%，远高于 Sulfo-Cy5-Cl 的 47.6% 和 43.0%。这一结果表明，Sulfo-Cy5-Br 是后续实验的理想光学探针。为验证其对膜蛋白的反应活性，本研究以含氨基和巯基的牛血清白蛋白（BSA）为代表蛋白进行测试。向 Sulfo-Cy5-Br 溶液中加入 BSA 后，其荧光强度提升了 3.1 倍，证实 Sulfo-Cy5-Br 可通过与 BSA 中的氨基或巯基发生共价结合实现标记。标记过程中荧光增强的主要原因，是探针中溴原子引发的重原子效应消失；Sulfo-Cy5-Br 与 BSA 结合物的绝对量子产率为 5.04%，显著高Sulfo-Cy5-Br 单体。理条件下，蛋白质表面的氨基通常处于部分质子化状态，质子化的氨基可与带负电的 Sulfo-Cy5-Br 发生静电作用，进而促进探针与蛋白表面氨基的共价反应。为验证这一假设，本研究通过考察不同 pH 条件下 BSA 存在时探针的荧光增强效应，探究了 Sulfo-Cy5-Br 与细胞膜表面蛋白质组的静电作用影响。结果显示，随着 pH 值从 8.0 降至 6.0，荧光增强比例逐步升高：pH 7.2 和 6.8 时，探针与 BSA 作用的荧光强度较 pH 8.0 略有提升；pH 6.0 时的增强比例为 pH 8.0 时的 2.5 倍。
基于 Sulfo-Cy5-Br 的细胞质膜永久性标记
Sulfo-Cy5-Br 的核心优势在于其细胞膜不透性，以及对质膜蛋白的高效标记能力，这使其成为一种可通过共价标记实现质膜蛋白靶向的新型探针。这种共价标记方式可避免 Sulfo-Cy5-Br 通过分子扩散穿过细胞膜进入细胞内部，从而解决传统质膜荧光探针易发生内吞的共性问题。为获得优异的成像质量，鉴于 Sulfo-Cy5-Br 对蛋白质的固有反应活性，建议在活细胞染色过程中采用 PBS 缓冲液而非培养基进行孵育。本研究以 Sulfo-Cy5-Br 为模型体系，通过系统实验优化了染色时长以最大化标记效率。当探针浓度为 20 μM、染色时长为 20 分钟时，即可实现对观测细胞的清晰、均一质膜标记。为进一步验证三种 Sulfo-Cy5 衍生物（Sulfo-Cy5-Br、Sulfo-Cy5-Cl、Sulfo-Cy5-H）对质膜的共价标记效率，本研究以 HeLa 细胞为模型进行质膜染色。染色 20 分钟后，Sulfo-Cy5-Br 和 Sulfo-Cy5-Cl 均可成功标记 HeLa 细胞质膜且信号清晰，而 Sulfo-Cy5-H 染色的 HeLa 细胞质膜背景荧光较强，难以实现清晰标记。Sulfo-Cy5-Br 对 HeLa 细胞质膜的标记信噪比高达 40:1，显著高于 Sulfo-Cy5-Cl 的 28:1 及 Sulfo-Cy5-H 的标记信噪比，证明 Sulfo-Cy5-Br 对质膜蛋白的共价标记效率优异。
为验证 Sulfo-Cy5-Br 的普适性，本研究测试了其对不同形态、来源的非癌细胞（HEK293T、16HBE 细胞）和癌细胞（HeLa、SW982、RAW264.7 细胞）的质膜标记能力。在优化的染色条件下，所有细胞的细胞质膜均呈现出明亮、均一且特异性的标记信号，表明 Sulfo-Cy5-Br 对多种细胞类型的质膜标记具有良好的普适性。Sulfo-Cy5-Br 的关键优势在于其与质膜表面蛋白的共价结合能力，可实现标记探针的永久性锚定。为评估 Sulfo-Cy5-Br 的锚定稳定性，本研究以 Sulfo-Cy5-H 为参照、DiI 为非共价标记对照，开展了抗洗涤实验。Sulfo-Cy5-H 染色的 HeLa 细胞洗涤前质膜轮廓模糊，洗涤后信号几乎完全消失，说明染料与质膜的作用较弱；DiI 因水溶性差导致标记效果有限，且洗涤后信号显著衰减；而 Sulfo-Cy5-Br 标记的 HeLa 细胞无论洗涤前后，均保持明亮的荧光信号。通过定量数据进一步体现了不同染料标记 HeLa 细胞质膜的荧光强度差异：DiI 洗涤后信号强度损失＞60%，而 Sulfo-Cy5-Br 仅损失＜10% 的初始荧光强度（信号降低或因少量探针未与膜蛋白发生反应）。这一结果证实，Sulfo-Cy5-Br 与质膜表面蛋白的共价结合，可实现抗洗涤的稳定、可靠标记。
活细胞质膜损伤的实时监测
两个磺酸基团的引入，赋予了 Sulfo-Cy5-Br 优异的水溶性和细胞膜不透性，使其可用于活细胞质膜损伤的实时监测。当质膜完整时，探针仅能标记质膜；而当质膜因内外源刺激（如 2,2'- 偶氮二异丁基脒二盐酸盐（AAPH）诱导的氧化应激）受损时，Sulfo-Cy5-Br 可穿过受损质膜，与胞内蛋白发生共价反应，进而产生广泛的细胞质标记信号。为验证这一假设，本研究对不同处理条件下的 HeLa 细胞进行了实验。对照组中 Sulfo-Cy5-Br 可特异性、高亮度标记 HeLa 细胞完整质膜；经 AAPH 处理 90 分钟后，部分细胞质出现微弱荧光，表明受损质膜允许探针进入并与胞内蛋白结合（其机制为 AAPH 产生自由基，与氧反应生成过氧自由基，破坏胞内抗氧化系统，最终导致质膜破裂和细胞死亡）；而经二甲基亚砜（DMSO，已知可广泛损伤细胞膜）处理的 HeLa 细胞，其细胞质和细胞核均呈现强荧光，说明 DMSO 对质膜的破坏作用使 Sulfo-Cy5-Br 可标记大量胞内蛋白；多聚甲醛（PFA）固定的 HeLa 细胞，其质膜通透性增加，探针可自由进入细胞，染色后细胞质成为主要标记区域（固定过程中质膜选择性通透丧失）。在程序性细胞死亡过程中，随着质膜完整性下降，染料会从膜表面转移至细胞质，最终在细胞核区域富集。这种逐步的胞内富集模式，可作为膜损伤程度的判断指标，为程序性细胞死亡进程的监测提供工具。
结论
本研究通过在花菁 5 荧光团中引入反应位点，开发了一种针对泛膜蛋白的静电导向共价标记方法。该策略可通过探针对靶蛋白的永久性共价结合，实现质膜动态的长期追踪。探针结构中两个磺酸基团的引入，确保了其对活细胞质膜的优异不透性；花菁母核中引入的卤素，可通过与蛋白中氨基、巯基的取代反应实现与膜表面蛋白的共价结合；带负电的探针可通过与蛋白表面质子化氨基的静电作用，实现靶向标记。这种共价结合方式可实现泛膜蛋白的稳定、永久性标记，从而支持活细胞质膜动态的长期观测。此外，该探针可对质膜受损细胞的胞内蛋白进行共价标记，在钙离子、LPS 等外源刺激诱导的细胞焦亡、坏死性凋亡等细胞事件追踪中具有潜在应用价值。
参考文献
Electrostatic-Directed Covalent Labeling of Pan-Membrane Proteins for Ultralong-Term Tracking of Plasma Membrane Dynamics, Shuyi Jiang, Ruihan Zhang, Xin Peng, Chuixi Kong, Tian Li, He Zhao, Jin Zhou, Hui Feng,* Zhigang Jin,* Zhaosheng Qian*,Anal. Chem. ，https://doi.org/10.1021/acs.analchem.5c05243
