摘要
光学和光声成像以其无创和高分辨率在生物医学应用中发挥着重要作用。荧光成像和光声成像成为解构分子信息和研究体内生物过程的有力工具。尽管化学探针的合成已经取得了很大的进展，但如何设计具有最佳荧光或光声成像性能的探针来动态可视化体内生物过程仍然是一个挑战。从这个角度出发，作者将重点介绍荧光和光声成像在体内的最新进展。此外，还将展示对未来体内成像的关注和展望。
光学成像
光学成像一般是指在一定程度上利用光学方式对体外或体内功能的特定微观结构进行成像的过程，包括荧光(FL)成像、化学发光(CL)成像、生物发光(BL)成像、持续发光(PL)成像等。与其他成像方式相比，光学成像，特别是FL成像，其直观的结果显示出敏感的评估，非常适合于生物成像和生物传感，通常涉及荧光团，其发光特性允许在激发后释放荧光到高能激发态的过程，通过输出激发光。具有代表性的荧光成像探针可分为以下三类:无机荧光团如量子点(QDs)、掺杂稀土离子的纳米颗粒(RENPs)、有机小分子和杂化有机荧光团修饰纳米探针。表1是FL探针的典型例子。
的确，在高灵敏度的同时，FL成像技术的发展也显示出从短波长向长波长的发展，这是科学研究中对事物进行更深入分析的趋势。在FL成像的几个传统窗口中，常规可见光区域在体内的成像效果相对较差，这是由于生物成像中入射激发光的穿透性低，散射强。由于设备和成像探头容易获得，可见区FL成像在一定程度上适用于体外成像仍然是一个不可回避的事实。
将较长波长的FL成像出现的成像窗口定义为NIR-I区域，在该区域穿透深度有明显提高，即使在厘米深度。最近，研究人员关注了NIR-II区FL成像的探头设计，该区域组织自身荧光噪声、信号衰减可以忽略，具有较高的信噪比(SNR)，适用于血管成像、脑成像等深层组织成像。
光声成像
在一定程度上，PA成像是一种光学成像和超声成像相结合的混合成像方式。在成像机理上，PA成像依赖于特定波长的入射激光束。当脉冲激光照射生物组织等成像部位时，组织中的吸收器吸收脉冲激光的能量，触发瞬态热弹性膨胀，在满足一定的热和压力限制时产生超声波，这被确定为Alexander Bell在19世纪80年代发现的光声效应。当输出的超声波被高灵敏度探测器接收后，通过相应的算法进行重构，就可以从PA图像中渲染出组织中的激光吸收图像。
光学成像与超声成像的有效结合，使PA成像具有光学成像的高对比度、基于光谱的特异性和超声成像的高穿透深度的双重优势，被誉为从实验室到临床最有前途的成像方式之一。成像造影剂促进了生物医学应用中PA成像的特异性和敏感性。典型的显像剂含有内源性和外源性造影剂，例如血红蛋白(含氧血红蛋白和脱氧血红蛋白)、脂质、水，甚至皮肤，它们对不同波长的光都有特定的吸收谱。通过对这些内在指标的PA成像，可以很容易地获得血氧、血流情况、体温等功能信息。然而，数量有限的内源性造影剂含量低，不能完全满足PA成像的快速发展；因此，研究人员将注意力转向设计具有强PA信号的外源性造影剂来区分成像区域。外源性造影剂有多种分类方法；在这里，他们使用了传统的有机和无机分类定义，其他的不再重复。
基于小分子染料的有机试剂，如吲哚菁绿(ICG)、BODIPY基染料、埃文斯蓝、亚甲基蓝等，由于其良好的生物相容性，首先进入了研究人员的视野。在激光照射下，染料的特定吸收能量可以迅速转化为PA信号，从而产生独特的PA图像。然而，有机染料在PA成像中的过度代谢和易光漂白限制了它的进一步应用。Yuan等研究了改良BODIPY分子用于PA成像引导光热(PTT)治疗的牛血清白蛋白(BSA)介导的自组装方法，该方法改善了水溶性，延长了体内停留时间。
无机材料也占据了PA成像造影剂的很大比例，具有易于功能化和光热转换的能力，涵盖零维(0D)到二维(2D)材料。无机造影剂的典型候选材料包括等离子体纳米材料和非等离子体纳米材料，其中前者(如金基纳米颗粒)主要依靠局部表面等离子体共振(LSPR)效应来超灵敏地调谐PA成像的光学效果，后者具有强光吸收。
PA成像技术为揭示生物过程的形态结构、功能代谢及生理病理特征提供了重要工具。研究人员致力于研究越来越多的探针，以获得更好的PA成像，具有更高的对比度，更高的灵敏度和多重识别。每个PA成像探头都有其优点和缺点。例如，小分子染料等有机探针具有良好的生物相容性和快速的肾脏清除率，但易漂白的特点限制了其在体内长期监测的应用。此外，无机探针具有较高的稳定性，但其体内毒性的潜在风险仍值得关注。
光学和光声成像的刺激响应成像。每种成像方式都有其独特的优势，在过去的几十年里，FL成像和PA成像的成像造影剂的设计已经取得了显著的进步。近年来，在造影剂设计领域，研究人员倾向于寻求刺激响应探头设计的进一步进展，即成像信号在受到刺激激活后会发生显著变化。激活信号通常呈现两种变化:一种是“开启”信号的类型，即从存在到不存在的成像信号;另一种是比值信号，其两个不同波长的信号在受到刺激后会呈现一定的比值关系。比率成像信号可分为两类: (1)以稳定信号作为参考信号，另一类在刺激激活下逐渐变化; (2)两种信号均有变化，且信号变化呈相互关联。刺激响应成像探针已经被广泛研究，其中主流的类型包括内源性和外源性刺激激活成像。
内源性刺激反应成像。疾病的发展通常伴随着局部生物内环境因素的相应变化。内源性刺激主要是人体内因素引起的生理病理变化，其中pH、氧化还原和关键过表达酶的化学差异是进一步研究的代表性目标。研究人员开发了一系列分子探针，能够被疾病进展过程中的特征分子激活，从而更好地在疾病的早期阶段进行准确的诊断和治疗。
ROS-响应成像。活性氧(Reactive oxygen species, ROS)主要是一类细胞内自由基，通常由线粒体产生，具有较高的氧化活性。对于大多数疾病来说，氧化和抗氧化失衡或过量摄取外源性氧化剂引起的氧化应激是一种常见的不平衡状态。过量的ROS可能会损伤核酸、蛋白质或脂质，也可能参与诱导缺氧因子(HIF-α)的产生，促进肿瘤的发展。因此，通过探针与ROS的反应来识别或消耗多余的ROS，有助于在疾病早期实现精确的诊断和准确的评估。作者研究了一种基于银/硫化银(Ag/Ag2S) Janus纳米颗粒的等离子体荧光探针，用于H2O2激活的NIR-II荧光，其响应成像能力通过肝损伤和荷瘤小鼠模型得到了验证。Huang等人构建了葡萄糖氧化酶(Gox)和Pd纳米酶组成的三维多光谱PA成像平台，在体内追踪H2O2介导的肿瘤治疗过程，结果显示可靠且无创的反馈，可指导疾病治疗。虽然获得的图像在H2O2响应光学成像和PA成像中表现出明显的差异，但最具挑战性的指标在于对体内ROS低浓度和不均匀分布的灵敏度，未来的研究可能会关注更高灵敏度和更高对比度的设计。
此外，Yi等人研究了组装金纳米粒子构建的HOCl触发纳米平台，其修饰的共轭表面可以被HOCl快速切割，从而引起电荷变化。反应探针注射HepG2荷瘤小鼠组的PA信号约为对照组的2.5倍，有助于疾病的精确诊断和治疗。Liu等人开发了一种由上转换纳米颗粒(UCNPs)、hcl识别分子和血脑屏障(BBB)靶向聚合物组成的混合纳米探针。体外和体内实验结果显示，纳米平台对HOCl具有敏感的反应性，具有实时反馈和无创诊断神经系统疾病的能力。此外，Liu等人还利用响应性NIR-II荧光成像在体内对·OH检测做出了贡献，他们构建了有机荧光团Hydro-1080，其中C - N键很容易被·OH氧化并变成C = N，从而在NIR-II窗口中产生Et -1080的“off-to-on”荧光。
RSS-Responsive成像。与病变部位ROS过多相对应，含有谷胱甘肽(GSH)、硫化氢(H2S)、多硫化物等的活性硫种(RSS)过表达也可诱导氧化失衡，其中肿瘤细胞中GSH含量远高于正常细胞，其体内可视化和检测一直是研究热点之一。此小组设计了一种基于稀土掺杂下转换纳米粒子(DCNPs)的比例NIR-II FL成像探针，其表面与4-硝基苯酚-cy7 (NPh)偶联。在病变区域遇到过表达的GSH时，808 nm激发的NPh在1550 nm处的NIR-II FL强度增强，而980 nm激发的DCNP在1550 nm处的NIR-II FL强度变化可以忽略，从而形成一个比值法的NIR-II FL图像，用于检测体内和体外GSH的含量。对于基于非辐射能量转移(NRET)效应的GSH响应探针的设计，提高DCNPs与有机染料的转移效率为未来的研究开辟了一条道路，例如匹配更高重叠度的染料。
此外，基于药物性肝损伤中H2S水平的上调，此课组设计了一种用于H2S激活的比例PA成像的小分子纳米探针。与依赖单个PA信号的“开启”成像相比，比例法PA成像在不受探针浓度和光漂白干扰的情况下，成像结果更加准确。
半胱氨酸(Cys)在氧化还原平衡调节、多肽合成、信号转导、细胞凋亡等生命系统中发挥着重要作用。如何在复杂的生命环境中精确地评估Cys的浓度仍然是一个挑战。Cheng等人设计了一种基于供体-π-受体(D-π-A)机制的可活化双模纳米探针，其荧光基团由双键部分连接，丙烯基作为Cys的识别位点。该探针对Cys具有较高的灵敏度(检出限为10.6 nM)，用于HepG-2肿瘤小鼠体内检测。注射应答探针的小鼠的荧光图像和PA图像均显示在Cys过表达的肿瘤部位有明显的信号。
此外，Li和同事利用比例近红外纳米平台实时监测H2Sn的浓度，其中重构的UCNPs作为能量供体，SiR1有机分子作为受体。将SiR1分子加载到UCNPs的DSPE-PEG外壳上，发光共振能量转移(LRET)起作用，诱导UCNPs在665 nm处猝灭荧光强度。然后，淬灭的荧光被H2Sn激活，由于亲核攻击Si -杂蒽环，并伴有吸收降低。所提出的响应性纳米探针为体内检测H2Sn提供了强有力的工具，并有助于精确分子成像的研究。
Enzymes-Responsive成像多种酶在肿瘤部位异常高表达，以维持和促进肿瘤的增殖、侵袭和转移。在这里，一些在病变部位特异性表达的酶经常被用作激活纳米探针的有效内源性刺激。Ye等人设计了一种基于NIR-FL和MR成像的酶响应型双模型纳米探针，其自组装能力可被内源性碱性磷酸酶(ALP)激活。影像学结果显示，结合MR成像和FL成像，对ALP阳性肿瘤的无创识别具有高灵敏度和高空间分辨率。这项工作使得基于小分子的双重成像模式能够精确检测体内酶。然而，病区ALP酶的定量结果需要更多的关注，以供今后的研究。caspase作为细胞凋亡的指标之一，密切参与细胞的生长、分化和凋亡调控。同时，通过分子成像在体内构建caspase浓度与治疗效果之间的关系，因其无创、灵敏度高，为临床转化提供了广阔的前景。然后，此研究小组设计了由NIR-II FL分子和NIR-II PA无机纳米颗粒组成的混合纳米复合材料，用于caspase-3介导的“开启”成像，并成功应用于小鼠模型的放射治疗效果评估。与传统的肿瘤体积测量、组织染色等方法相比，基于活化NIR-II FL/PA成像的实时动态评估有助于更准确地预测治疗效果，避免治疗延误。Li等报道了一种基于DNA的荧光纳米探针，用于检测端粒酶和无嘌呤/无嘧啶内切酶1的活性。荧光报告基因只有在两种酶的特异性裂解触发下，才会呈现出由off-to-on状态的荧光变异，这为酶在体内活化成像的生物功能研究提供了有力的工具。在这项工作中，如何提高探针的大规模生产和良好的生物相容性需要更多的纳米合成努力。
pH-Responsive成像。除上述过表达物质外，肿瘤等病变部位的内部微环境与正常组织存在显著差异。快速增殖的肿瘤细胞表现出由于营养运输不足而导致的能量代谢改变，称为Warburg效应，导致细胞外代谢物(如乳酸)的积累，导致肿瘤微环境的细胞外空间pH值低至6.5-6.8左右。利用这种独特的微环境，研究人员还设计了许多不同的响应部分，以在体内形成活化的PA/FL成像。此小组设计了一种有机-无机杂化Janus纳米复合材料，其复合材料包括提供稳定参考信号的有机半导体染料和提供可变PA信号的响应性等离子体金纳米颗粒。该探针可用于精确传导pH值，825 nm处与690 nm处的吸收强度比值值在8.0 ~ 5.0范围内呈良好的线性关系。
由其他因素激活的响应成像。铜(II) (Cu2+)等重金属离子的过度积累被认为是阿尔茨海默病(AD)的典型特征之一，如何在不造成额外侵入性损伤的情况下长期监测Cu2+的浓度是常规临床方法面临的挑战。Jiang等人将超薄硒化锌(ZnSe)纳米薄片用于体内Cu2+阳离子交换，实现了“off-to-on”可激活的PA图像。而此课题组设计了一种活化的纳米探针，用于威尔逊病(WD)中Cu2+响应的NIR-II PA成像和表面增强拉曼散射(SERS)成像，其比例SERS强度可用于肝脏中Cu2+的定量检测。使用Au纳米间隙纳米颗粒(AuNNPs)的NIR-II PA成像表明，入射激光在生物组织中的散射和吸收减少。开发可靠的金属离子可视化检测纳米探针在生物医学领域具有重要的应用价值。
MicroRNA (miR)在肿瘤转移和复发中发挥重要作用，其含量与代谢性疾病、心血管疾病、神经退行性疾病等密切相关。Kuang等人制作了一个有趣的核心-卫星结构，其中被DNA序列功能化的AuNPs是核心，外围卫星是CdSe/ZnS量子点，其荧光在组装的结构上被猝灭。被相应的miR激活后，核与卫星之间的连接子被发夹序列的杂交破坏，释放出量子点的猝灭荧光。该激活成像策略具有较小的背景干扰，成功应用于荷瘤小鼠模型的无创FL成像。实时动态监测炎症过程对疾病的早期诊断和干预至关重要。然而，传统的临床诊断方法只能呈现特定时间点的内部微环境。RNA是炎症和癌症的潜在生物标志物之一，在调节炎症过程中起着关键作用。它的高灵敏度检测可以更好地揭示炎症的早期迹象。在此基础上，Li等人设计了基于炎症信号放大策略的酶触发分子信标，实现了炎症相关RNA的实时、动态成像。研究人员将探针应用于炎症小鼠模型，包括爪炎和肝损伤，对体内疾病相关RNA的成像显示出敏感性和特异性。不断发展的RNA 响应纳米探针预示着潜在的中心作用，阐明体内潜在的生物学机制。由于缺乏空间分辨率和选择性，用于RNA检测的探针很少能应用于体内光学或PA成像，这可能是未来改进的研究方向之一。
外源性刺激-响应成像。作为一种外部控制的刺激，光可以通过简单地调整功率、波长和曝光时间，实现对光响应纳米平台的实时、无创和高局部精度操作。与传统可见光相比，近红外光对生物组织具有更高的穿透性。此团队设计了一个近红外光激活的纳米平台，将Au纳米棒(AuNRs)如NIR II PA成像探针与IR-1061和NIR II FL成像探针结合在一起。当探针与Ru-complex和PEG组装时，由于AuNRs的LSPR效应，IR-1061的NIR-II PA信号增强，而NIR -1061的NIR-II FL信号被淬灭。输出的激光照射可以激活Ru配合物，导致组装的纳米结构坍塌，这也有助于NIR-II FL信号的增强。光控激活策略有利于纳米探针在体内的精确监测。大规模生产的统一形态仍然是一个紧迫的问题，这限制了临床翻译。
US已广泛应用于临床内部组织成像，进一步疾病的诊断和治疗。US的安全性和无创性已被广泛应用于触发深层组织渗透的“按需”远程给药，已得到认可。然而，低空间分辨率的US成像阻碍了精确的生物医学应用。通过结合NIR-II PA成像和US控制的主动推进特性，此课题组设计了一种基于纳米马达的Janus纳米探针，用于主动NIR II PA成像引导癌症治疗。利用AuNRs-mSiO2 Janus纳米马达负载US响应的2,2偶氮双[2-(2-咪唑啉-2-基)丙烷]二盐酸(AIPH)，其氮-氮双键断裂产生氮气作为动力。在荷瘤小鼠模型的PA成像实验中，与未照射组相比，经US处理的各组肿瘤穿透能力更深。对于US反应系统，需要进一步考虑，以确保US在体外应用的力量适合体内实验的复杂情况。也许升级成像探头的对比度和改进US装备的实时反馈将有助于解决这些问题。
纳米技术和新型刺激反应纳米探针的不断发展为体内疾病诊断提供了新的思路。然而，不同类型的疾病具有不同的物理化学特征，其内在刺激因素也相对不同。整合疾病内在微环境中的多种刺激，设计级联反应成像系统，有助于精准诊断，全面促进靶向诊断。
总结与展望
在过去的几十年里，分子成像由于其独特的物理化学性质而获得了相当大的关注，并为加强诊断提供了有利的机会。精确分子成像的个性化纳米平台的不断发展要求新型纳米探针能够在生物环境中进行全面和灵敏的检测。在各种成像方式中，光学成像因其无辐射、灵敏度高等优点，已广泛应用于基础生物医学研究和临床转译。然而，由于组织的散射和吸收，在深层组织中很难获得高分辨率的光学成像结果。光声成像适合于深层组织成像，得益于超声成像的无限穿透性和光学成像的出色对比度和分辨率的混合集成。大量的分子成像探针已经被报道，以便进行这两种类型的成像分析，更好地检测和精确监测相关的生理和病理过程。为了简单起见，作者根据不同的成像方式将成像探针分为三种主要类型，包括有机纳米探针、无机纳米探针和混合纳米探针。在此基础上，总结了近年来响应成像策略的研究进展，并根据内源性响应模块和外源性响应模块对纳米探针的响应类型进行了分类。开发各种纳米探针用于光学成像和体内PA成像仍然是一个开放的话题，因为它们有趣的相互作用化学。虽然已经研究了大量的成像探针，但仍存在不可忽视的障碍，需要进一步研究。在高灵敏度的基础上提高穿透深度一直是光学成像领域面临的主要挑战。研究人员倾向于将传统可见光区的发射波长提高到近红外区，甚至NIR- II区。不用说，这个策略是成功的。尽管如此，用于NIR-II FL成像的探针是不够的，仍然应该进行研究。对于NIR-II FL成像的两种主要探针之一，包括无机纳米探针，如半导体量子点和稀土离子掺杂纳米粒子，它们的代谢问题仍然存在。另一类用于NIR-II FL成像的纳米探针是有机染料或小分子，与第一类相比，它们具有更好的代谢能力，对于这一类来说，稳定性是主要关注的问题，因为它们在生理介质中容易漂白，并且NIR-II FL成像的分子效率有限。NIR-II PA成像的障碍主要来自以下几个方面:首先，由于吸收光谱的尾迹特性，NIR-II成像的纳米探针设计困难，在NIR-II范围内发现的峰很少。其次，一些用于NIR-II PA成像的仪器在NIR-II区域的发射光较弱，这对探头本身的性能提出了额外的要求，导致了微弱的PA信号转换。展望光学成像和PA成像的未来，迫切需要从以下几个方面解决上述问题:(1)提高NIR-II区纳米探针的量子产率;(2)为NIR-II区无机纳米探针的生物安全性开发了一种新的解决方案;(3)在NIR-II区研究具有多重刺激激活的PA/FL信号的纳米探针，以减少背景干扰。最后，光学和PA成像纳米探针的设计需要更多地关注其综合稳定性、生物相容性和生物降解性，适合特定疾病的靶向能力和敏感的激活特性，这可能有助于进一步的临床转化。
参考文献
Optical and Photoacoustic Imaging In Vivo: Opportunities and Challenges. Xuan Zhang, Ying Wu, Lanlan Chen, Jibin Song, and Huanghao Yang. Chem. Biomed. Imaging 2023, 1, 99−109. DOI: 10.1021/cbmi.3c00009
