内容提要
准确的术中组织识别是肿瘤手术的关键，但传统方法费时费力，大大延迟了术中决策的时间。本文提出了一种基质金属蛋白酶MMP14激活NIR-II纳米探针(A&MMP@Ag2S-AF7P)用于快速无扰动组织分析进行体外和体内神经母细胞瘤诊断。A&MMP@Ag2S-AF7P在正常组织中荧光微弱，通过抑制神经母细胞瘤中过表达的MMP-14介导的Ag2S量子点与A1094之间的荧光共振能量转移(FRET)而迅速激活，膜穿透肽R9(TAT 肽)可以使纳米探针在癌细胞中有效内化，提供更高的肿瘤-正常(T/N)组织比。病变的即时判别和肿瘤边缘的确认使纳米探针成为适合癌症手术或组织活检程序的快速诊断试剂。
靶向可激活纳米探针A&MMP@Ag2S-AF7P的制备主要包括三个步骤，分别是Ag2S量子点的合成、MMP14活性肽的制备(MMP@Ag2S-AF7P)、A&MMP@Ag2S-AF7P的构建。A&MMP@Ag2S-AF7P的TEM如图所示，在水溶液中表现出良好的分散性，平均粒径为160nm。经过后续的表面改性，各种纳米颗粒的水动力直径从80nm到270nm。Zeta电位测量结果显示，Ag2S、Ag2S-AF7P、MMP@Ag2S-AF7P和A&MMP@Ag2S-AF7P的表面电荷存在明显差异。该纳米探针在1094nm处表现出强烈的吸收，由于有效的FRET效应，NIR-II窗口的荧光信号很弱。当A1094/Ag2S的摩尔比为120:1时，淬火效率达到78%。
本研究的癌细胞检测原理是基于MMP14介导的荧光激活。高效和特异的酶活性被认为是A&MMP@Ag2S-AF7P实现快速检测癌细胞的必要条件。作者通过记录A&MMP@Ag2S-AF7P在生理-上对各种主要生理离子和分子的反应来检测其选择性。在A&MMP@Ag2S-AF7P溶液中加入特定的MMP14酶，激发了纳米探针的快速荧光恢复，荧光强度的定量分析显示增强了近5倍。MMP14的酶活性受到其抑制剂GM6001的抑制，纳米探针的荧光回收率明显受到抑制。这些数据都表明A&MMP@Ag2S-AF7P纳米探针对MMP14的高特异性。采用实时荧光光谱分析方法监测了MMP14活化A&MMP@Ag2S-AF7P荧光的动态过程。加入MMP14后，观察到NIR-II荧光信号稳定增加，同时近红外吸收体A1094快速释放。96%的纳米探针可在45 min内发光，表明其快速高效的酶响应。没有MMP14的对照组表现出较弱的NIR-II荧光信号。以上结果表明，A&MMP@Ag2S-AF7P可被MMP14快速而特异地激活。
为了检验A&MMP@Ag2S-AF7P快速术中组织学诊断的能力，作者测试了纳米探针的性能，以分析从动物模型和临床标本中获得的组织样本。首先，从KP-N-NS荷瘤小鼠中切除的新鲜肿瘤组织切成1 mm厚，使用A&MMP@Ag2S-AF7P通过简单的一步染色进行组织分析。30分钟后，宽带多路显微镜荧光显微成像显示组织的某些区域有强烈的NIR-II荧光信号，与DAPI细胞核染色很好地匹配。随后，对同样的肿瘤组织进行标准HE染色，肿瘤区域的精确共定位证实了A&MMP@Ag2S-AF7P对肿瘤的精确检测能力，验证了A&MMP@Ag2S-AF7P纳米探针在精确识别临床肿瘤组织方面的潜力。将NB患者的肿瘤组织与A&MMP@Ag2S-AF7P孵育30分钟，并进一步用DAPI染色。在肿瘤组织和转移组织中可见明显的NIR-II荧光强度。MMP14抑制剂(GM6001)预孵育的肿瘤组织的荧光强度明显弱于未孵育的肿瘤组织。由于T/N高于正常的组织比(T/N=7.6)，可以清楚地识别出肿瘤边缘，因此A&MMP@Ag2S-AF7P只能在肿瘤组织中被精确激活。临床免疫组化(IHC)结果进一步表明A&MMP@Ag2S-AF7P对NB肿瘤细胞具有较高的特异性。
作者通过腹腔接种过表达MMP14的人肾上腺NB细胞KP-N-NS来检测腹腔转移模型中体内术中诊断的可行性。在成功地将制备好的A&MMP@Ag2S-AF7P纳米探针腹腔注射到小鼠体内，剂量为2.5mg×kg-1，采用NIR-II成像系统进行体内荧光成像。最初，在小鼠的腹部观察到无法检测到的荧光。然后，荷瘤小鼠腹腔多个部位被NIR-II荧光点亮，荧光斑数量在45min内保持相对稳定，T/N比高。在NIR-II荧光成像的引导下，将这些斑点从小鼠体内去除，同时以裸眼手术作为对照(每组5只)。然后收集NIR-II荧光成像引导下和未引导下切除的结节，并进行HE染色分析。结果A&MMP@Ag2S-AF7P引导手术共切除44个结节，阳性率84%，明显优于裸眼手术(62%)共切除33个结节。由于这种靶标可激活的NIR-II荧光成像策略的高灵敏度和特异性，在NIRII荧光成像的指导下，可清晰识别125mm以下的肿瘤结节大小。肿瘤响应性A&MMP@Ag2S-AF7P纳米探针具有优越的T/N信号比和高灵敏度，能够检测微小的不可见病变，有助于在未来的临床实践中更高效、准确的手术。
由于NB起源于神经嵴的胚胎交感肾上腺谱系，通常发生于腹部或肾上腺髓质，作者采用瘤周组织中存在的主要细胞类型来检测A&MMP@Ag2S-AF7P的细胞摄取。A&MMP@Ag2S-AF7P浓度为30mg×mL-1分别在37°C下保温2小时。上述细胞对A&MMP@Ag2S-AF7P的荧光激活影响很小，而NBKP-N-NS细胞可以很快被照亮，这意味着A&MMP@Ag2S-AF7P对MMP14具有高特异性。因此，进一步证明了我们的纳米探针对过表达的MMP14酶具有高度特异性的识别和激活NB，确保了其对NB的准确和灵敏诊断。为了验证A&MMP@Ag2S-AF7P的生物安全性，作者进行了一系列的体外和体内研究。MTT实验和流式细胞术分析表明，有听不清细胞毒性KP-N-NS细胞和L929细胞与A&MMP@Ag2S-AF7P孵化后24h A&MMP@Ag2SAF7P的浓度的增加(从0到160mg×mL-1),发生凋亡和坏死的KP-N-NS细胞和L929细胞数量与未加A&MMP@Ag2S-AF7P处理的对照组相比差异无统计学意义。Balb/c小鼠在第1天和第7天，经IP注射PBS溶液和A&MMP@Ag2S-AF7P后，血液学评估和血液生化分析进一步揭示了A&MMP@Ag2S-AF7P对治疗小鼠的毒性作用。与对照组相比，注射后1天和7天的血液学和生化指标均无统计学差异。作者还获得了Balb/c小鼠IP注射PBS溶液和A&MMP@Ag2S-AF7P，提示无炎症细胞或细胞坏死。基于以上结果，在成像浓度下，A&MMP@Ag2S-AF7P对小鼠的毒性可以忽略。
结论
作者成功地开发了一种肿瘤特异性酶激活NIR-II纳米探针，用于快速无扰动组织分析，用于离体和体内NB诊断。A&MMP@Ag2S-AF7P既包含MMP14靶向肽AF7P，又包含其在聚阳离子细胞穿透肽(R9)和聚阴离子片段(E8)之间的可剪切连接子。Ag2S量子点的NIR-II荧光通过过表达MMP14特异性识别NB细胞后，由于FRET的破坏而迅速激活，同时膜穿透肽R9暴露导致纳米探针在NB细胞内高效内化。独家NB细胞染色，染色时间很短，没有组织固定和冷冻切片，分子水平的精确诊断，以及良好的生物相容性，使a&MMP@Ag2S-AF7P纳米探针足够作为快速诊断试剂纳入癌症手术或组织活检程序。该策略可扩展到其他肿瘤，实现术中检测和精确手术，具有很大的临床应用潜力。
参考文献
Rapid Unperturbed-TissueAnalysis for Intraoperative Cancer Diagnosis Using an Enzyme-Activated NIR-IINanoprobe, Yang Zhan, Sisi Ling, Haoying Huang, Yejun Zhang, Guangcun Chen,Shungen Huang, Chunyan Li,* Wanliang Guo,* Qiangbin Wang*, Angew. Chem. Int. Ed.2021, 60, 2637 –2642. https://doi.org/10.1002/anie.202011903.
