内容提要
表面活性剂剥离胶束由一种商业可用的六氟磷酸盐(CyFaP)形成，并用于近红外II区(NIR-II)的高对比度光声成像(PAI)。将辅酶Q10负载到表面活性剂剥离的CyFaP胶束(ss-CyFaP)提高了产量和存储稳定性，并使其在NIR-II区产生接近用于PAI的Nd-YAG激光器1064 nm输出的峰值吸收波长。ss-CyFaP水相分散体表现出强烈的NIR-II光学吸收，ss-CyFaP的光声信号可以穿过12 cm的鸡胸脯组织被仪器检测到。在临床前动物模型中，ss-CyFaP通过3.1 cm覆盖的鸡乳腺组织在大鼠引流淋巴结中可见。经静脉给药后，ssCyFaP在原位乳腺肿瘤小鼠和大鼠肿瘤组织中积累，并且不会产生急性的毒性副作用。在三名女性志愿者上证明了ss-CyFaP可在2.6 – 5.1 cm深处对整个压缩的人类乳房进行光声成像，从而表明ss-CyFaP是一种可对深部组织进行NIR-II区光声成像的造影剂。
结果与讨论
本文采用市售的 NIR-II 染料花菁氟烷基磷酸盐CyFaP，评估了表面活性剂的剥离。稳定的离子对使染料可溶于有机溶剂。将CyFaP的二氯甲烷溶液滴入10% w/v F127的搅拌水溶液中形成CyFaP胶束，然后进行二氯甲烷蒸发。CyFaP 在二氯甲烷和F127中的吸收光谱如图所示。在DCM中，在NIR-II窗口，CyFaP的吸收峰接近1013 nm。CyFaP分散在Pluronic F127胶束中，在1020 nm左右有轻微的峰移。将F127溶解的CyFaP进行表面活性剂剥离，用多余的水(pH 6.5)洗涤胶束，使用100 kDa截留分子量(MWCO)的离心过滤装置在4℃下进行表面活性剂剥离，CyFaP的吸光度在1040和1120 nm处有明显的双峰移动。由于Pluronics独特的温度敏感临界胶束浓度(CMC)特性，这类表面活性剂能够进行低温表面活性剂剥离。F127能够有效地在低温下离心过滤浓缩CyFaP溶液，而其他常见的制药表面活性剂(如Cremephor EL和Tween 80)则不能。图显示了ss-CyFaP产生高NIR-II对比度的效率，而典型的脂质体不能有效溶解CyFaP。表面活性剂剥离可提高NIR-II吸收数量级，这对PAI造影剂成像非常有用。
不幸的是，在冷藏过程中间，ss-CyFaP会聚集，几天后沉降比较明显。与活性载物一起装载的其他疏水性分子可能会抑制胶束聚集。各种共载物包括维生素D3 (D3)、β-胡萝卜素(β-car)、α-生育酚(α-toc)和辅酶Q10 (CoQ)用于稳定ss-CyFaP。CyFaP胶束与CoQ或α-toc共载改善了剥离过程中的染料保留率，而维生素D3和β-car的影响很小。CoQ共载质量比至少为0.6:1，能提高ssCyFaP的产率。后续研究使用共载质量比为1:1的CyFaP。由于CoQ和α-toc是安全且生物相容性良好的分子，广泛应用于维生素补充剂中，并且在表面活性剂剥离过程中也能提高产量，因此我们对这些共载物进行了进一步评估。为了评估共载疏水性维生素或类维生素分子是否提高稳定性，分别用单独的CyFaP或与CyFaP共同加载的ss-胶束制备α-toc或CoQ。样品在4 ℃保存，并监测分散染料的稳定性4周。通过样品的NIR-II吸光度来评价制剂的稳定性。ss-CyFaP胶束在第一周表现出聚集，只留下70%的染料包裹在分散的胶束中。α-toc共载ss-CyFaP胶束在第一周后表现出略高的稳定性，但在第二周结束时约有40%的染料聚集。另一方面，CoQ共载ss-胶束在贮存4周后聚集率小于5%。CoQ共载增强稳定性的机理尚不清楚。然而，它可能是基于与胶束疏水核心中的CyFaP的相互作用，导致聚集减少。ss-CyFaP包含CoQ导致CyFaP吸收峰轻微移动。在所有后续的研究中，除非另有说明，否则CoQ均被包含在ss-CyFaP中。为了量化F127表面活性剂的剥离，使用硫氰酸钴测定法来测量F127。在pH为6.5的条件下，CyFaP-CoQ胶束经过5次洗涤循环后，游离和松散的F127几乎完全被清除。此外，CyFaP和CoQ以最小的损失保留在ss-胶束中。电子显微镜(EM)显示ss-CyFaP胶束为球形，直径在 10 ~30 nm之间。通过将ss-CyFaP胶束与50%胎牛血清(FBS)在37℃下孵育，体外评估ss-CyFaP胶束在生物环境中的稳定性。24 h后，NIR-II吸光度没有变化，表明血清在体外生物介质中的稳定性。
为了研究ss-CyFaP的深层组织成像，我们进行了离体PAI研究。将含有ss-CyFaP胶束的假体置于鸡乳房组织之间并进行成像。使用一个大型塑料容器来存放用于PAI研究的鸡胸肉。将大约1.25 mL的ss-CyFaP胶束(15 mg mL-1染料)或水放入内径为5 mm的塑料管中，并在管子的顶部和下方堆放了12 cm的鸡胸组织的容器。鸡胸组织在各个方向围绕管子12 cm，以排除任何方向的漏光。图3B显示了假体PAI研究的设置照片。图显示假体覆盖的PA/ US图像，该假体包含一个装满水的管子(左)或ss-CyFaP(右)，放置在鸡乳房组织下方12厘米处。在11.6厘米的深度上，可以清晰地看到包含水的幻影(左)发出的美国信号(灰度级)，但没有检测到PA信号。然而，对于充满ss-CyFaP的管，在幻肢12cm深度的US(灰度级)和PA(彩色级)均清晰可见，显示了深层组织PA造影成像能力。发现来自更深处的PA信号被噪声所掩盖。为了提高信噪比(SNR)，我们在相同深度下获取100帧，并对其进行平均。通过去除鸡胸肉层，计算了不同深度的信噪比。在12 cm深度，信噪比为24.3 dB。为了确保CoQ在1064 nm时没有干扰，在15 mg mL-1下制备了单独的CoQ胶束并进行了成像。含有ss-CyFaP的试管显示出强烈的PAI信号，而CoQ本身未被检测到。
无创成像技术如PAI已被用于SLN检测。为了证明ss-CyFaP胶束的淋巴结成像能力，我们通过足垫给大鼠注射5 mg kg-1 ss-CyFaP胶束。注射后30分钟进行PAI，将1 – 5 cm鸡胸组织置于淋巴结区域上方。ss-CyFaP胶束的PA信号通过放置在淋巴结区域顶部的3.1 cm鸡胸堆清晰可见。体外可视化证实ss-CyFaP在淋巴结中积累。通过3.1 cm外组织淋巴结PA反应的信噪比为26.5 dB。淋巴结产生的PA振幅与对照信号相比，染料注射区域高出近六倍。为测定ss-CyFaP的药代动力学特性，将60 mg kg -1染料静脉注射到健康ICR小鼠体内。在不同的时间间隔采集血液，根据血清在1064 nm处的吸光度估计血液中染料的含量。图4E显示了不同时间点的ssCyFaP胶束在血液中的吸光度。ss-CyFaP胶束的半衰期为5.6 h。接下来，为了确定给药后染料的位置，将原位4T1肿瘤的BALB/c雌性小鼠尾静脉注射60 mg kg -1 ss-CyFaP胶束。6 h后处死小鼠，取肝、脾、肾、心及肿瘤。组织均质，1500 rcf离心，测定匀浆上清液的吸光度。大约10%的注射剂量每克在6小时的时间点在肿瘤中积累。大多数的CyFaP被发现积累在肝脏和脾脏。为了进一步证明ss-CyFaP作为PAI造影剂的多功能性，我们在小鼠和大鼠中进行了肿瘤成像研究。小鼠肿瘤成像研究是在原位4T1肿瘤受试者中进行的。小鼠注射ss-CyFaP 60 mg kg-1，注射6 h后成像。用于小鼠和大鼠肿瘤成像的光学设置如图支持信息中的图S7所示。1064 nm成像显示注射6 h后肿瘤中PA信号强烈，与ss-CyFaP积累的生物分布数据一致。未接受对比剂的对照组小鼠的肿瘤没有显示PA信号。发现CyFaP胶束的NIR-I和NIR-II光谱特征与切除肿瘤的体外PA光谱相似，表明CyFaP染料在肿瘤中积累后仍保持完整。接下来，我们在大鼠模型中进行了肿瘤成像研究，以评估ss-CyFaP胶束在大型肿瘤动物中的PAI能力。通过尾静脉注射55 mg kg-1 ss-CyFaP胶束，6 h后成像。只有给予ss-CyFaP的大鼠肿瘤中观察到PA信号。这些结果证明了ss-CyFaP胶束在体内对PA肿瘤成像的能力。在活体啮齿动物肿瘤成像实验中，PAI系统产生的光强度约为12 mJ cm-2，比ANSI安全极限100 mJ cm-2低了好几倍。为了确定在PAI中使用的1064 nm脉冲激光是否导致光热加热，我们在12 mJ cm-2的激光照射下监测了10分钟内集中的ssCyFaP的温度，这是用于体内动物实验的能量。与生理盐水对照相比，观察到不到3 oC的升高。这表明，在某些情况下，应考虑用集中对比剂进行光热加热的可能性。
鉴于ss-CyFaP胶束的高NIR-II吸收和体外深层组织成像获得的良好结果，我们试图通过整个人类乳房对染料进行成像。人类乳房PAI研究的设置如图所示。将一个含有ss-CyFaP胶束的试管被放置于健康成年女性志愿者的乳房下。进行PA/US成像，并使用MATLAB重建结果。通过健康人类志愿者的压缩乳房组织显示管子的PA信号。ss-CyFaP的PAI可以通过以下乳房深度的所有志愿者检测导管:2.6 cm(左侧为c罩杯尺寸的志愿者1)，3.8 cm(中间为d罩杯尺寸的志愿者2)，5.1 cm(右侧为c罩杯尺寸的志愿者3)。在最大成像深度，一些非特异性背景信号在管上方可见，但管中的PA对比度清晰可检测。激光能量照射到人的乳房表面测量为21 mJ cm-2，这是远远低于100 mJ cm-2 ANSI安全限制在1064 nm。这样增加激光功率就可以进一步改善信号噪声，增加成像深度。这些结果表明，ss-CyFaP胶束作为人类深层组织PAI造影剂的潜力。
结论
ssCyFaP胶束是使用一种市售染料形成，并通过共载CoQ稳定下来。这种方法得到一种胶体PA造影剂，具有极强的NIR-II造影剂。ss-CyFaP通过12.0 cm的鸡胸组织成像，这是迄今为止报道的最深的组织光学成像之一。在小鼠和大鼠中进行的研究显示了淋巴和肿瘤成像的能力，并观察到最小的毒性。使用ss-CyFaP首次演示了整个人类乳房的成像，进一步证明了深层组织成像的能力。
参考文献
Surfactant-StrippedMicelles for NIR-II Photoacoustic Imaging through 12 cm of Breast Tissue andWhole Human Breasts, Upendra Chitgupi, Nikhila Nyayapathi, Jeesu Kim, DepengWang, Boyang Sun, Changning Li, Kevin Carter, Wei-Chiao Huang, Chulhong Kim,Jun Xia, and Jonathan F. Lovell*, Adv. Mater. 2019, 1902279.https://doi.org/10.1002/adma.201902279.
