内容摘要
开发具有强羟基自由基(·OH)形成的I型光敏剂(ps)在厌氧肿瘤治疗中尤为重要。另一方面，如何获得高效的固态分子内运动来促进分子机器和分子马达的发展是一个挑战。然而，他们之间的关系从未透露。本文研制了一种具有显著供体-受体效应的吡嗪基近红外I型PS。值得注意的是，通过分子内工程和分子间工程的结合，使分子内运动几乎最大化，同时引入无限的键拉伸振动，促进基团旋转。实现了分子内运动引起的光热转换，效率高达86.8%。PS的D-A构象也能诱导0.07 eV的极小单重态-三重态分裂，这对促进三重态敏化的系统间交叉至关重要。有趣的是，它的光敏性与分子内运动密切相关，剧烈的运动可能会产生强烈的·OH生成。鉴于其优异的光敏性和光热行为，生物相容性PS显示出优越的成像引导癌症协同治疗。这项工作促进了先进PS在生物医学应用和固态分子内运动方面的发展。
结果与讨论
通过4,4-二溴苯并与硼酸取代芳胺衍生物的Suzuki偶联反应合成了Py-PS，然后与5,6-二氨基-2,3-二氰吡嗪进行环化反应(方案S1，支持信息)。经柱层析纯化后，得到了理想的产物，产率令人满意，其结构通过1H和13CNMR和高分辨率质谱进行了很好的表征。Py-PS在四氢呋喃、二氯甲烷、二甲亚砜等常见有机溶剂中具有良好的溶解度。这使得Py-PS可以通过纳米沉淀法以两亲性的1,2-二硬脂酰sn-甘油-3-磷酸乙醇胺- n-[甲氧基(聚乙二醇)-2000](DSPE-mPEG2000)为基质制备成水分散的NP。Py-PS NPs的包封效率高达94.6%。紫外可见光谱显示，Py-PS NPs在约640 nm处峰值最大，在700-900 nm范围内有明显的近红外吸收。这表明，在分子中引入具有强电子亲和性的吡嗪基单元可以诱导显着的电荷转移跃迁到吸收红移，这有利于改善体内成像或治疗应用中的激发深度。然而，Py-PS NPs的荧光被明显猝灭，在光致发光(PL)光谱中没有检测到信号。进一步研究了Py-PS NPs的形态和大小。透射电子显微镜(TEM)显示出均匀的球形颗粒，平均尺寸约为≈60 nm，这与动态光散射(DLS)的结果非常吻合。此外，在两周内，NPs在水和磷酸盐缓冲盐水(PBS)中的吸收强度和粒径变化较小，表明其具有良好的化学和胶体稳定性，可以长期储存。在808 nm, 1.0 W cm−2的连续10 min激光照射下，Py-PS NPs的紫外可见光谱变化可以忽略不计，表明其具有良好的抗光漂白稳定性。
由于Py-PS NPs没有发射，根据能量守恒原理，分子激发态的热失活可能占主导地位。为了验证这一假设，对Py-PS NPs的光热转换能力进行了评估。在连续激光照射(808 nm, 1.0 W cm−2)下，NPs溶液的温度迅速上升，并在5分钟内达到稳定状态，而在相同条件下，水的温度变化可以忽略不计。NPs的升温速率取决于染料浓度和激光功率，较高的浓度和功率可能导致更快的温度升高。因此，这些因素可以很好地控制热量的产生。根据所报道的方法计算出Py-PS NPs的光热转换效率为86.8%，远高于商用有机染料、半导体聚合物纳米颗粒和金纳米棒等，据作者所知，这是目前报道的光热材料中效率最高的之一。此外，NPs经过6圈加热-冷却过程后，没有观察到温度衰减。这表明NPs具有良好的光热稳定性，在近红外激光照射下具有长期光疗的优点。
尽管在Py-PS NPs中发现了明显的光热效应，但它们仍然具有显著的·OH生成能力。研究了不同ROS指标的激光照射(808 nm, 1.0 W cm−2)下Py-PS NPs(染料，1 μM)的光敏行为。作者首先使用双醋酸二氯荧光素(DCFHDA)进行PL测试，因为它被视为检测整体ROS的指标。结果表明，经过30 min的辐照后，氧化产物的绿色荧光急剧增加了>6 × 102倍。而在相同的辐照条件下，仅Py-PS NPs或DCFH-DA几乎检测不到荧光信号。
同时，采用一种商用ROS染料(Ce6)进行同样的研究，但由于在近红外区缺乏吸收，只能获得信号丢失。因此，作者的染料可以利用其明显的近红外吸收来产生高效的活性氧。然后，用9,10-二甲基镧(ABDA)、羟基苯基荧光素(HPF)和二氢霍达明(DHR) 123进一步分析活性氧的种类，这三种氧通常分别用于表示1O2、·OH和O2˙¯的生成。ABDA的紫外可见光谱显示，在有激光照射和没有激光照射的情况下，NPs之间的信号损失较小，没有差异，这意味着可以排除1O2的产生。但经DHR 123处理的NPs经过30 min光照射后，荧光增强非常微弱，而含HPF的样品在相同条件下，荧光增强幅度大于2 × 104倍。这表明作者的染料是一种具有强特异性·OH生成的I型PS，而这种性能以前很少报道。值得注意的是，实体瘤通常是厌氧的，而I型PS对氧的依赖性较小，更有利于肿瘤的治疗。另一方面，I型光敏产生的·OH是ROS中毒性最大的，在实际治疗中表现出较高的活性。因此，作者的PS凭借其优异的·OH和光热生成能力，可能成为治疗癌症的优越治疗剂。有趣的是，染料的光敏性似乎与其光热行为有关。例如，DCP-PTPA是一种近红外染料，作者之前报道过它的结构类似于Py-PS。但由于缺乏甲氧基，其光热性能明显下降。在808 nm激光激发下，其光热转换效率为65.5%，远低于Py-PS。此外，根据与上述相同的方法评估其ROS生成能力。奇怪的是，在这种情况下，可以清楚地识别DCP-PTPA NPs中的1O2产生，这反映在辐照下ABDA的吸收损失上。PL研究表明，在30分钟激光照射下，DCP-PTPA NPs产生的O2˙¯要比Py-PS NPs明显得多。相比之下，通过指标的荧光变化监测到·OH和总ROS生成率明显降低。因此，光热效应较高的Py-PS NPs更容易产生·OH。
然后进行了理论仿真，更好地了解了Py-PS的特性。采用高斯09包笼法在TD-PBE0/6-31G(d,p)水平上优化得到的S1构象表明，Py-PS是自然扭曲的，特别是其苯胺分支扭出吡嗪平面。从静电电位图中可以看出，吡嗪基单元由于电子亲和力强，具有明显的负静电电位，而供电子芳胺单元的静电电位相对为正。这可能会导致给体和受体之间发生强烈的分子内电荷转移，从而显著减小能隙，从而诱导近红外吸收，这与观察结果一致，即其最高占位分子轨道(HOMO)和最低未占位分子轨道(LUMO)分别占据芳胺和吡嗪单元，重叠非常小。此外，由于分子在光激发后的产热与构象松弛或分子运动引起的非辐射跃迁有关，因此重组能是评估运动相关能量消耗的关键作用之一，因此使用MOMAP包进行研究。计算得出Py-PS基态和激发态的휆分别为2004和2656 cm−1。无论在哪种状态下，与键长变化对应的高频振动模型(通常来自键的拉伸振动)和与二面角变化对应的低频振动模型(通常来自苯基的旋转)对휆都有显著的贡献。但前者的影响比后者更明显，也占了很大比例。因此，分子激发后的键拉伸振动主导了结构弛豫。由于键拉伸振动通常在短距离内剧烈发生(0.1 Å)，因此可以在不受外界环境约束的情况下有效进行，因此被认为是将激发态能量转化为热量的最佳途径。进一步的研究表明，这些运动主要由引入的吡嗪单元控制。注意pyrazine单元的基态和激发态之间的构象变化较小，这证明了作者基于分子内工程的观点，即键拉伸振动是剧烈且无限的。此外，虽然苯基从芳胺分支的旋转对重组能的贡献也很明显，但由于强分子间相互作用引起的空间效应，这种运动通常更难进行。这可以通过引入附在分子上的甲氧基来解决，增加聚集态的分子间间隙，造成不规则堆积，从而产生有效的自由空间进行基团旋转。它与Py-PS的粉末x射线衍射分析吻合良好，衍射图中衍射峰丢失，而在DCP-PTPA中可以观察到明显的衍射。此外，Py-PS NPs的PL信号即使在77 K也无法收集，通常认为77 K是冻结分子运动以增强发光的超低温。因此，分子内和分子间工程可以协同导致剧烈的固态分子运动，从而实现强烈的光热转换。
Py-PS在空间中较大的HOMO-LUMO分离，由于激发态中具有相反自旋的价电子之间的排斥力减少，导致了0.07 eV的极小ΔEST。同时，Py-PS的S1态和T1态具有相同的电子构型，表现为有99%的可能性从HOMO跃迁到LUMO。这种激发态特性保证了ISC从S1到T1状态作为有效通道，进而触发三重态光敏产生ROS。作者的研究表明，光敏化行为似乎与光热效应有关。例如，Py-PS表现出比DCP-PTPA更强的光热转换。它有一个特殊而有效的·OH生成。但这种作用在DCP-PTPA中被削弱，而其他活性氧如1O2和O2˙¯则更强。然而，这种行为本质上是与分子内运动相关的。由于ROS的形成是竞争性的，光诱导的电子转移可以通过分子碰撞短暂发生，而更强的分子内运动可能促进与氧的碰撞形成O2˙¯而不是1O2，随后发生有利的质子化反应、不成比例反应和热解反应，加速了·OH的形成。
受Py-PS NPs优异性能的启发，进一步评估其在癌症治疗中的生物应用。在体内治疗前，研究了体外细胞实验，如NPs传递行为和光触发细胞凋亡。由于Py-PS是不发光的，因此制备了荧光素(FITC)标记的Py-PS NPs (FITC-Py-PS NPs)，该NPs在跟踪中可以发出绿色荧光。FITC-Py-PS NPs(染料，50 μM)孵育小鼠乳腺癌4T1细胞后，共聚焦激光扫描显微镜(CLSM)可采集到明显的绿色荧光信号，与LysoTracker Red和Hoechst 33342(活细胞核染色指标)共染色实验表明，这些NPs主要通过内吞过程锚定在溶酶体上。在NaN3(能量抑制剂)和氯丙嗪(网格蛋白介导的内吞抑制剂)存在或低温下，细胞摄取效率明显降低，这一事实证实了这一点。然后，为了研究细胞内ROS生成能力，以DCFH-DA为指标，将细胞分为PBS、PBS +激光(L)、Py-PS NPs和Py-PS NPs + L处理四组。CLSM结果显示，只有NPs经过5分钟激光照射(808 nm, 1.0 W cm−2)的细胞，ROS的氧化产物才会发出明显的荧光信号，而在对照组中则没有检测到这种信号，这表明利用NPs良好的光敏特性产生了显著的ROS。不同处理后的细胞分别用碘化丙啶(PI)和双醋酸荧光素(FDA)染色，分别作为荧光探针监测死细胞和活细胞。可以清楚地看到，NPs和激光同时处理组只能获得来自PI的红色荧光，而其他组只能看到来自FDA的绿色荧光。这些结果表明，Py-PS NPs可以通过协同光疗有效地杀死癌细胞。
为了更好地阐明细胞死亡机制，采用Annexin V-FITC/PI检测法进行细胞凋亡试验。结果表明，Py-PS NPs + 808 nm激光照射后，4T1细胞凋亡率约为86.4%，而其他组未见明显凋亡。此外，在808 nm激光照射的情况下，使用不同浓度的Py-PS NPs进行CCK-8测定。结果表明，在0 ~ 100 μM的染料浓度范围内，NPs对癌细胞的暗毒性可以忽略不计。NPs与小鼠成纤维细胞(3T3)、人脐静脉内皮细胞(HUVEC)、人肝细胞(LO2)等正常细胞共培养时也发现了类似的现象。因此，它们在与细胞共存时具有良好的生物相容性。然而，在光照射后，随着染料浓度的增加，癌细胞的数量逐渐减少，并且在100 μM下几乎所有的细胞都被杀死，进一步证实了Py-PS NPs具有良好的光诱导癌细胞消融能力。
然后，在原位4T1乳腺荷瘤小鼠尾静脉注射的基础上，研究了Py-PS NPs在体内的应用。由于PyPS NPs具有优异的光热转换性能，有望对肿瘤获得显著的光热效应。通过热成像监测，在激光照射(808 nm, 1.0 W cm−2)下，注射NPs后小鼠肿瘤部位温度从35.3°C迅速升高到56.4°C，并在3 min时达到平稳。作为对照，经生理盐水处理的小鼠仅能观察到微弱的体温升高。这说明NPs不仅可以通过增强的通透性和滞留效应在肿瘤中积累，而且在光激发后还可以引发有效的热转换。光声成像具有空间分辨率高、穿透深度深等优点，通常情况下，光热剂升温引起的热弹性膨胀会引起压力变化，从而产生光声信号。因此，进一步评价PY- PS NPs肿瘤的PA显像。结果表明，由于内源性黑色素和血红蛋白等生物底物的背景噪声，NPs在注射前表现出非常弱的PA信号。注射后，信号随时间显著升高。注射后12 h，可在肿瘤部位采集到明显的PA信号，其强度在24 h时几乎达到峰值，随后由于代谢作用缓慢下降。Py-PS NPs良好的PA成像特性使其成为成像引导癌症治疗的有用工具。
除了Py-PS NPs光热效应引起的成像行为外，它们还有望作为协同治疗癌症的治疗剂。为研究其体内抗肿瘤效果，将肿瘤体积达到≈100 mm3的小鼠按上述方法随机分为4组(n = 5)。光照射组在注射NPs或生理盐水后24 h，用808 nm激光(1.0 W cm−2)治疗小鼠10 min，其余组只注射生理盐水或生理盐水。在15天的研究期间，每组每三天记录一次肿瘤体积。结果显示，随着时间的推移，未激光照射组和仅注射NPs组的肿瘤体积明显增大。与此形成鲜明对比的是，NPs和激光治疗组肿瘤明显消除。因此，Py-PS NPs带来的协同光疗引起了肿瘤的显著光消融。此外，通过组织学和免疫组织化学分析研究了其治疗机制。肿瘤切片苏木精和伊红(H&E)染色显示，“Py-PS NPs + L”组破坏性肿瘤组织坏死较其他组严重。末端脱氧核-肽基转移酶dUTP缺口末端标记(Tunel)免疫荧光染色进一步证实，可以清晰地检测到用于监测死亡细胞中断裂DNA链新生成DNA链的荧光信号。此外，增殖标志物Ki67在对照组中表达量较高，而“Py-PS NPs + L”组表达量可忽略，提示其可有效抑制癌细胞增殖。此外，NPs +激光组血小板内皮细胞粘附分子-1 (CD31)表达明显低于对照组，说明Py-PS NPs光疗协同作用对肿瘤生长有较好的抑制作用。这些都表明作者的NPs具有良好的治疗性能，加上优越的成像行为，使作者的NPs非常适合癌症的治疗。
最后，由于Py-PS NPs的生物安全性已被视为实际应用中不可缺少的因素，因此对其进行了研究。首先，作者对小鼠红细胞进行了体外溶血试验，结果表明，Py-PS NPs在0.1 ~ 100 μM的不同浓度范围内具有良好的血液生物相容性(图S22, support Information)。随后，检查了Py-PS NPs的体内生物安全性。在15天的时间内，四组小鼠的体重差异较小。第15天，采集各组小鼠血样，进行血常规和生化指标分析。碱性磷酸酶(ALP)、丙氨酸转氨酶(alt)、天冬氨酸转氨酶(AST)、白蛋白(ALB)肝功能指标和肌酐(CREA)、尿酸(UA)、尿素氮(BUN)肾功能指标在“Py-PS NPs + L”组与对照组之间变化可忽略不计。值得注意的是，常规血液检查显示，Py-PS NPs加激光照射小鼠各项指标均在正常范围内，而对照组由于肿瘤进展严重，出现异常，进一步说明Py-PS NPs生物毒性可忽略不计，光疗效果有效。提取小鼠的心、肝、脾、肺、肾等主要脏器，组织切片进行H&E染色分析。结果表明，尽管各器官的组织形态不同，但各器官的细胞形态和分布非常相似，各组均未发现炎症病变。这些发现共同表明作者的NPs在生物医学应用中表现出很高的生物相容性。
结论
综上所述，作者提出了一种吡嗪基PS (Py-PS)，由于引入了吡嗪强电子受体和芳胺电子给体，它表现出了显著的D-A效应。它不仅能对深层组织激发产生明显的近红外吸收，还能对三重态致敏诱导极小的ΔESTto增强ISC。此外，Py-PS在聚集状态下的分子内运动几乎可以通过分子内工程和分子间工程实现最大化。吡嗪单元的加入使分子产生较强的键伸缩振动，不受外界环境的限制，而附加的甲氧基可以作为间隔物使分子分离，从而产生更多的自由体积，促进芳胺分支中苯基的旋转。这些因素可以引起剧烈的分子内运动，将激发态能量转化为热量，Py-PS NPs的光热转换效率高达86.8%。值得注意的是，活跃的分子内运动促进了I型光敏，形成了强而特异性的·OH。由于Py-PS NPs具有优异的光敏性和光热性能，在协同光疗的作用下，可以在癌细胞中触发高效的ROS和热生成，导致明显的细胞死亡。此外，在PA成像的指导下，Py-PS NPs的协同治疗可以引起活体小鼠体内肿瘤的显著光消融。Py-PS NPs具有良好的生物安全性，在实际应用中有望治愈厌氧肿瘤。本工作的意义在于:i)尽管I型PSs在厌氧肿瘤治疗中显示出巨大的潜力，但自由基ROS的生成相当复杂，且总是竞争性的。作者的工作提供了一种具有强·OH形成的近红外PS，这在癌症治疗中是非常理想的，因为它是ROS中最具反应性的，可以提高疗效;固态分子运动的研究在分子机器和分子马达的发展中是非常有用的，但由于聚集态的分子间相互作用很强，因此一直被禁止。作者利用吡嗪单元的无限键伸缩振动和间隔分子间间隙来促进分支中苯基的旋转，从而使其更有效地促进固态分子的运动，从而将双工程结合起来;iii)作者的工作首次揭示了剧烈的分子内运动可以促进I型光敏，并具有强而特异性的·OH形成，从而为设计受分子内运动刺激的高级PS提供了策略。因此，这项工作可能促进PS相关生物治疗和固态分子内运动的快速发展。
参考文献
Type I Photosensitization with Strong Hydroxyl Radical Generation in NIR Dye Boosted by Vigorous Intramolecular Motions for Synergistic Therapy.Runfeng Lin, Junkai Liu, Weilin Xu, Zicheng Liu, Xiang He, Canze Zheng, Miaomiao Kang, Xue Li, Zhijun Zhang,* Hai-Tao Feng, Jacky W. Y. Lam, Dong Wang, Ming Chen,* and Ben Zhong Tang*.Adv. Mater. 2023, 2303212.https://doi.org/10.1002/adma.202303212
