内容提要
我们提出一种自下而上的磁增强光动力疗法（magneto-PDT）范式，采用氟苯取代的五甲川花菁作为 I 型活性氧生成剂。基于自由基对机制和磁场效应，光敏剂与氧自由基之间显著的 g 因子差异（Δg）使得 Cy5-3,4,5-3F 介导的羟基自由基（・OH）和超氧阴离子自由基（O₂・⁻）的产生具有磁响应性放大作用，在 500 mT 时产率分别实现最高 66.9% 和 28.0% 的提升。在多种癌细胞模型中，这种磁增强的氧自由基生成相较于传统 PDT 方案，展现出普遍的细胞毒性优势。小鼠乳腺癌 4T1 细胞的半抑制浓度（IC₅₀）在常氧和缺氧条件下均显著降低，其中在常氧条件下的降低最为明显，从单独 PDT 的 0.91 μM 降至磁动力 PDT 的 0.38 μM。
合成与光物理性质
花菁 Cy5 是一种经典的母体染料，具有近红外吸收和发射特性、良好的水溶性及较低的生物毒性。为促进电子转移过程，我们在 Cy5 骨架的中位引入了具有吸电子特性的氟取代苯基，并通过 Suzuki-Miyaura 交叉偶联反应将不同的氟代苯基硼酸基团连接到 Cy5 单元上。Cy5-R 在二氯甲烷（DCM）中保留了约 650 nm 的近红外最大吸收波长（λₐᵦₛ），而由于取代基的吸电子作用，其相应的荧光发射波长从 671 nm 偏移至 667 nm。Cy5-R 的荧光量子产率（Φբ）在 14.0%-17.3% 之间，可在光疗期间实现荧光成像引导。
光诱导活性氧生成及光敏机制
活性氧的生成能力是光敏剂（PSs）的一项关键特性。首先，通过 2'，7'- 二氯二氢荧光素（DCFH）的荧光增强，证实了四种基于 Cy5 的化合物的总活性氧生成量，其中 Cy5-R 的总活性氧产率是 Cy5 的 2.2 至 3.1 倍。接着，在二氯甲烷（DCM）中，使用 1,3 - 二苯基异苯并呋喃（DPBF）作为单线态氧（¹O₂）探针，以指示光敏剂在照射下的单线态氧生成能力。与 Cy5 相比，添加 Cy5-R 后 DPBF 的漂白速度更慢，且 Cy5-3,4,5-3F 的单线态氧量子产率（ΦΔ）大幅降至 1.3%，这表明 II 型光动力疗法的能量耗散途径受到抑制。随后，我们分别使用羟苯基荧光素（HPF）和二氢乙锭（DHE）在水溶液中评估羟基自由基（・OH）和超氧阴离子自由基（O₂・⁻）的生成情况。Cy5-R 体系使 HPF 和 DHE 的荧光显著增强。特别是在 Cy5-3,4,5-3F 的作用下，HPF 和 DHE 的荧光强度分别增强了 11.6 倍和 7.4 倍。实验结果表明，Cy5-R 生成・OH 和 O₂・⁻的能力是通过氟苯修饰形成的，同时其生成单线态氧的能力有所减弱。
磁场增强氧自由基的生成
在 I 型光敏过程中，光敏剂与氧自由基之间的自旋非极化电子转移遵循自旋角动量守恒原理，因此自由基对（RP）中间体的自旋构型同时分布在单重态（S）和三重态（T）中。关键在于，三重态自由基对更易发生自由基逃逸，从而促进 I 型反应途径，而单重态重组则主要生成笼状产物，抑制自由基释放。这就需要通过强大的磁场调控自旋演化动力学，以促进单重态向三重态的转化及氧自由基的生成。因此，我们选用具有显著氧自由基生成能力的 Cy5-3,4,5-3F 进行磁场增强实验。我们先后采用羟苯基荧光素（HPF）和二氢乙锭（DHE）进行光谱测量，研究磁场（0-500 mT）与光照射协同作用对羟基自由基（・OH）和超氧阴离子自由基（O₂・⁻）生成的磁场效应。与零磁场对照组相比，HPF 的荧光强度在磁场作用下显著增强。通过磁场依赖性荧光增强光谱对・OH 的生成趋势进行分析，并基于 515 nm 处的发射计算磁场效应。磁场效应图显示，・OH 生成的增强呈现双相性，初期快速增长后趋于饱和，在 500 mT 时产率提升达到最大值 66.9%。在相同条件下对 DHE 进行的平行测量显示，O₂・⁻的生成也呈现类似的磁场增强趋势，在 585 nm 处的双相变化使 500 mT 时的产率提升达到 28.0%。
体外治疗效果分析
受氧自由基生成显著增加的鼓舞，我们评估了磁场增强光动力疗法（magneto-PDT）对小鼠乳腺癌 4T1 细胞的作用效果。首先，通过共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）记录的细胞荧光强度变化，反映了 Cy5-R 在体外细胞内的摄取行为。孵育 1 小时内，Cy5-R 就在 4T1 细胞中快速积累。由于在水溶液中，500 mT 磁场对 Cy5-3,4,5-3F 介导的羟基自由基（・OH）和超氧阴离子自由基（O₂・⁻）生成的调控达到饱和，因此该磁场强度（B=500 mT）被用于后续的 magneto-PDT 实验。通过观察羟苯基荧光素（HPF）、二氢乙锭（DHE）和 2,7 - 二氯二氢荧光素二乙酸酯（DCFH-DA）的荧光信号，证实了细胞内活性氧（ROS）生成的磁场增强效应，与黑暗对照组相比，光激活组（660 nm，6 J/cm²）的信号明显增强。定量分析显示，在光 - 磁双重处理下，・OH、O₂・⁻和总 ROS 的荧光强度分别是单纯光处理组的 1.82 倍、1.20 倍和 1.68 倍。鉴于 Cy5-3,4,5-3F 具有优异的磁场增强细胞内・OH 和 O₂・⁻生成能力，我们随后采用甲基噻唑基四唑（MTT）法进行了体外磁场增强光毒性实验。在常氧条件下，Cy5-3,4,5-3F 在黑暗中对 4T1 细胞的细胞毒性可忽略不计，无论是否存在磁场均是如此。相反，经照射（660 nm，24 J/cm²，20 分钟）后，Cy5-3,4,5-3F 以浓度依赖的方式抑制癌细胞增殖，在 5 μM 浓度下细胞存活率为 27.9%。特别是，经 Cy5-3,4,5-3F（5 μM）处理的 4T1 细胞在照射（660 nm，24 J/cm²，20 分钟）联合 500 mT 磁场作用后，存活率降至 11.1%。magneto-PDT 表现出优异的恶性细胞抑制效果，其半抑制浓度（IC₅₀）为 0.38 μM，低于单纯 PDT 的 0.91 μM。此外，I 型 magneto-PDT 在缺氧条件下仍保持抗缺氧治疗性能，与传统 PDT 相比，对缺氧实体瘤的抑制效果更显著。常氧和缺氧条件下的 MTT 实验结果表明，magneto-PDT 具有更强的抗癌效果，在抑制缺氧实体瘤方面更具优势。通过钙黄绿素 - AM / 碘化丙啶（PI）进行的活 / 死细胞检测图像直接显示，magneto-PDT 组的肿瘤细胞几乎被完全消融。
体内应用
我们研究了 Cy5-3,4,5-3F 介导的磁场增强光动力疗法（magneto-PDT）对转移性肿瘤的抑制作用。通过将 4T1 细胞直接接种到 BALB/c 小鼠的乳腺脂肪垫，建立了原位肿瘤模型。7 天后，当肿瘤体积达到约 100 mm³ 时，将小鼠随机分为 6 个治疗组。随后进行肿瘤内注射 Cy5-3,4,5-3F（50 nmol 剂量，溶于 100 μL 载体），这种方式可实现药物的高效富集，同时减少全身暴露，从而对恶性肿瘤进行精准治疗。后续治疗后，每隔一天观察这六组荷瘤小鼠。在光 - 磁双重作用（650 nm，100 mW/cm²，10 分钟）条件下，经磷酸盐缓冲液（PBS）处理的原位肿瘤生长迅速，14 天内肿瘤体积增至初始的 8.4 倍，这证实了近红外照射和磁场暴露本身的抑制作用可忽略不计。同时，注射光敏剂后，在黑暗条件或单独磁场处理下，肿瘤抑制效果仍较微弱，这是因为 Cy5-3,4,5-3F 在没有光激活的情况下无法生成活性氧。虽然单独光动力疗法（PDT）能暂时抑制肿瘤生长，但在第 10 天出现复发，表明单一疗法难以实现持续的疾病控制。值得注意的是，光 - 磁双重处理显著增加了羟基自由基（・OH）和超氧阴离子自由基（O₂・⁻）的产生，从而实现了显著的肿瘤抑制效果。到第 14 天，所有接受该治疗的小鼠肿瘤完全消退，仅胸部表皮出现轻微结痂。在整个研究期间，各实验组均未出现与治疗相关的不良反应，且小鼠体重稳步增长。
结论
本研究通过调控 Cy5-3,4,5-3F 介导的自由基对体系中的自旋演化，建立了磁场增强抗肿瘤光动力疗法的机制框架。通过在 Cy5 的中位引入多氟苯基进行功能修饰，我们开发出一种 I 型光敏剂（Cy5-3,4,5-3F），它具有优异的吸收效率、线粒体 - 内质网双靶向性以及耐缺氧的活性氧生成能力。在水溶液中，具有光活性的 Cy5-R 会产生细胞毒性氧自由基，同时形成由光敏剂自由基和氧自由基组成的自旋非极化自由基对中间体。在 0-500 mT 的磁场强度范围内，受 g 因子差异（Δg）机制调控，对磁场敏感的自由基对中间体会发生磁场依赖性的自旋态调控。与无磁场条件相比，该磁场效应使 500 mT 时的活性氧产率分别提升 66.9%（羟基自由基）和 28.0%（超氧阴离子）。在光 - 磁双重激活下，氧自由基生成能力的提升使得磁场增强光动力疗法（magneto-PDT）通过破坏亚细胞器，在常氧和缺氧条件下均能高效抑制癌细胞增殖。与传统光动力疗法（PDT）相比，magneto-PDT 的细胞毒性更优，在常氧条件下 4T1 细胞的半抑制浓度（IC₅₀）从单独 PDT 的 0.91 μM 显著降至 0.38 μM。在肝癌细胞（HepG2）和乳腺癌细胞（MCF-7）中也观察到类似的治疗效果提升。
参考文献
Spin Manipulation Engineering of Photodynamic Intermediates:Magnetic Amplification of Oxyradicals Generation for Enhanced Antitumor Phototherapeutic Efficacy,Jiuyu Lu, Junying Ding, Zhuoran Xia, Zhuo Yang, Chengyuan Lv, Shenglin Zong, Jianfang Cao, Danhong Zhou, Saran Long, Wen Sun, Jianjun Du, Jiangli Fan,* and Xiaojun Peng,J. Am. Chem. Soc. 2025, 147, 18100−18109,https://doi.org/10.1021/jacs.5c04111
