内容提要
本研究在两种癌细胞系中鉴定了一种半花青衍生物，它是一种有效的细胞凋亡诱导剂。这种化合物触发了标志性的细胞凋亡特征，包括ER肿胀、线粒体形态学变化、增加超氧化物的产生，和半胱天冬酶非依赖性细胞死亡。这种活性依赖于探针共价修饰巯基的能力。使用生物素化的，基于活性的探针进行的蛋白质组学分析显示Sec 23同源物A和GDP-解离抑制剂α是参与paraptosis激活的潜在靶点。这种先导化合物已经显示出一定程度的选择性，这些发现确立了半花菁化学家族作为用于凋亡研究的有前景的支架。
结果与讨论
半花菁类化合物的细胞毒性与亲电性相关
半花菁化合物1-5将显示不同程度的亲电性，由于取代基R的电子性质的吲哚片段这些化合物按照文献合成。在HEK 293中测定了这些化合物的半数最大抑制浓度（IC 50）。在不同的条件下，HeLa（子宫颈癌）和MDA-MB 231（三阴性乳腺癌）人细胞在不同的细胞水平上进行了细胞培养。化合物的毒性受到R取代基（C3）的电负性变化的显著影响。随着取代基电负性的增加，化合物显示出更高的细胞毒性，在所有细胞株中显示出一致的趋势，鉴于半花青是迈克尔受体，我们解释这种趋势表明这些化合物的毒性与它们的亲电性有关。因此，化合物1-5可以作为蛋白质中亲核残基如半胱氨酸的共价配体（见下文）。此外，我们研究了在C14位的氧原子和氮原子的影响。为了探索这种效应，我们合成了化合物2-NH2，通过用胺（− NH2）基团取代化合物2中的羟基（−OH）基团。含氮化合物2NH 2的细胞毒性低于其氧-含有类似物2。考虑到化合物2中的氧具有7.0 ± 0.2的pKa，β在中性pH下大部分去质子化，得到整体中性分子。相反，化合物2-NH2在生物学相关的pH值范围内不能去质子化总电荷的这种变化降低了2-NH2的膜渗透性，并影响其亚细胞定位，如荧光显微镜和共定位分析所证实的。尽管化合物1应该比化合物2更亲电，但它在三种细胞系中表现出相似的细胞毒性这种看似违反直觉的观察可以通过考虑随着亲电性的增加，化合物1也比化合物2更容易与谷胱甘肽（GSH）反应来解释。因此，化合物2显示出足够的亲电性以潜在地修饰蛋白质残基，但不足以被细胞中丰富的GSH基本上捕获。鉴于其效力和有利的性质，我们选择化合物2来表征这类亲电化合物的生物效应并鉴定其分子靶点。
化合物2激活非凋亡细胞死亡机制
为了确定化合物2是否触发非凋亡机制，我们通过测量用化合物2处理的HeLa细胞中的半胱天冬酶-3/7活化来评估凋亡诱导。使用荧光探针CellEventTM半胱天冬酶-3/7绿色，以及核酸染色剂SYTOTM深红，检测半胱天冬酶3/7切割。作为阳性对照，DMSO作为阴性对照，zVADFMK作为泛半胱天冬酶抑制剂。与对照相比，用化合物2处理的细胞没有表现出显著的半胱天冬酶-3/7活化如所预期的，用zVAD-FMK随后STS预处理的细胞不显示半胱天冬酶活化。在同一实验中，我们评估了细胞收缩和核碎裂，这两种细胞凋亡的特征。我们的发现表明，与STS处理相反，化合物2不诱导细胞核碎裂或细胞收缩。这些结果表明化合物2不触发半胱天冬酶活化、细胞核碎裂或细胞收缩，表明涉及非凋亡途径。
化合物2诱导ER和线粒体的形态学变化
我们接下来评估了化合物2诱导的三种细胞系中ER和线粒体的形态学变化。HEK 293、HeLa和MDA-MB-231细胞与化合物2孵育2小时，并用ERTracker TM绿色染色。在所有三种细胞系中观察到细胞质空泡化。另外，空泡膜用ER-TrackerTM绿色染色，表明它们的ER起源。我们使用KDEL保留序列（KDELmTurquoise 2）用靶向ER腔的荧光蛋白转染细胞，并将它们与化合物2孵育2小时。 共聚焦延时显微镜显示这些空泡含有荧光蛋白，证实它们起源于内质网扩张。我们通过将化合物2与用线粒体探针PKmito DEEP RED染色的HeLa细胞孵育，监测线粒体的形态变化及其在空泡形成中的作用在添加化合物2后5分钟开始，形态变化是明显的，并且观察到特征性的甜甜圈形形态。15分钟后，PKmito DEEP RED探针开始泄漏到胞质溶胶中，表明线粒体去极化。
化合物2增加超氧化物的产生
活性氧（ROS）主要在线粒体中产生，并且它们在细胞死亡机制中具有重要作用。我们评估了用化合物2处理的HeLa细胞中这种自由基阴离子的产生。我们使用了化合物2的衍生物，荧光探针HKSOX-1（HKSOX-1*）检测细胞内O2 ·−。我们采用抗霉素A（一种细胞色素c还原酶抑制剂，可增加细胞内O2 ·−浓度）作为阳性对照，用化合物2处理的细胞显示出显著更高的O2 ·- 与对照组处理的细胞相比，这种增加具有剂量依赖性。
化合物2独立于胱天蛋白酶和O2·−诱导ER去乙酰化并被环己酰亚胺抑制
凋亡异常是一个不涉及半胱天冬酶激活的过程，空泡化过程可以被蛋白质合成抑制剂放线菌酮（CHX）抑制。我们评估了泛半胱天冬酶抑制剂zVAD-FMK和CHX对化合物2诱导的空泡形成的影响。将DMSO用作阴性对照，将不存在抑制剂的化合物2用作阳性对照。用化合物2处理2小时后，zVAD-FMK（20 μM）不能拯救细胞免于ER空泡化。另一方面，用CHX（20 μM）预处理部分防止空泡形成，如空泡化细胞百分比较小所证明的。这些结果证实了空泡化是一个不依赖半胱天冬酶的过程，ER扩张是由蛋白质的积累驱动的。然而，这种反应似乎比ER中未折叠蛋白质反应（UPRER）的开始更快，因为BiP/GRP 78的上调，在该时间点未观察到。这些观察结果与近凋亡细胞死亡机制一致。这些观察结果与近凋亡细胞死亡机制一致。通过用O2 ·−清除剂Tiron（100 μM）预处理细胞，在空泡形成过程中积累。预先用清除剂处理不会影响空泡形成过程，该观察结果表明，O2 ·−在空泡的形成中不起作用。我们接下来测试ER扩张是否影响线粒体形态。我们转染HeLa细胞，在用CHX（20 μM）预孵育2小时后，将细胞与化合物2再共孵育2小时。共聚焦延时显微镜显示，所有细胞均显示线粒体损伤，无论它们是否含有ER空泡。
化合物2与可溶性蛋白质组中的可配体半胱氨酸结合
化合物2是一种有能力的亲电试剂，可以与硫醇基亲核试剂如GSH。我们接下来通过基于凝胶的、定性的基于活性的蛋白质谱（ABPP）评估该反应性是否延伸至蛋白质中的半胱氨酸残基。我们从HeLa细胞的裂解物纯化可溶性蛋白质组并用化合物2处理。我们使用反应性探针ATTO 620马来酰亚胺标记可配位的半胱氨酸。对照蛋白质组仅用ATTO 620马来酰亚胺处理。 用十二烷基硫酸钠分离这些蛋白质组，聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）显示，ATTO 620马来酰亚胺（5 μM）标记的半胱氨酸在某些蛋白质中被化合物2以剂量依赖性方式阻断（10 - 200 μM）。该观察结果强烈表明化合物2与蛋白质中的可配位半胱氨酸残基反应，阻断这些位点。我们假设由化合物2触发的倒错可能与细胞内蛋白质靶标的游离巯基的共价修饰相关，导致巯基蛋白质稳态的破坏。我们对所有半花青1 - 5进行了前面描述的竞争性ABPP实验。该实验揭示了半胱氨酸标记的程度与化合物的亲电性、其毒性以及其诱导ER空泡化的能力。
化合物2与凋亡的潜在调节剂结合
我们假设化合物2与参与paraptosis的特定含巯基蛋白相互作用。为了鉴定这些蛋白质靶点，我们采用了基于质谱的ABPP,42，45 - 47，并合成衍生自化合物2的生物素化探针另外，为了鉴定与巯基修饰潜在无关的靶标，我们使用基于化合物5的生物素化探针，（5-生物素），其是2的结构类似物，具有减弱的亲电性和缺乏亲核分裂诱导活性。重要的是，用IA处理细胞不诱导ER空泡化，因此在鉴定被化合物2特异性接合并参与空泡化的靶标中充当有价值的对照。我们用2-生物素、5-生物素或IA-生物素处理细胞裂解物，用于基于ABPP的靶富集。随后使用液相色谱-串联质谱法（LC-MS/MS）通过蛋白质组学分析鉴定。将用DMSO处理细胞裂解物后捕获的蛋白质用作阴性对照，而2-生物素、5-生物素和IA-生物素用于鉴定特异性相互作用物。我们使用SAINT express软件49来识别重要的靶标，我们将其定义为贝叶斯错误发现率（BFDR）阈值为0.05，经验倍数变化评分（EFC）阈值为2的靶标（log2（EFC）≥ 1，使用2-生物素或IA-生物素富集了近3000种蛋白质。生物素是一种强大的亲电试剂，能够在所用浓度（10 μM）下与许多蛋白质反应。然而，2-生物素不会不加选择地与亲核半胱氨酸反应，例如，当使用IA-生物素有效富集蛋白质二硫键异构酶PDI 3 −6时，在2-生物素富集的级分中未检测到它们。由于IA不诱导ER空泡化和近端变性，我们推测与2-生物素反应但不与IA生物素反应的蛋白质可能参与这种表型的诱导。我们将2-生物素的log 2（EFC）和-log 10（BFDR）阈值设定为>3，IA-生物素的阈值设定为<1，并鉴定了13种被2-生物素强烈富集但不被IA生物素强烈富集的蛋白质在我们的ABPP实验中，我们用生物素化的探针处理全细胞裂解物，活细胞成像显示，化合物2在内质网（ER）中显著富集，如与ER特异性标记物共定位所示;因此，从13种蛋白质的亚组中，我们仅关注已知定位于ER的那些。基于这些考虑，三种蛋白质成为ER空泡化的潜在驱动因子：Sec 23同源物A（SEC 23 A）、GDP解离抑制剂α（GDI 1）和氧固醇结合蛋白1（OSBP）。
总结
凋亡异常是细胞凋亡无效时的另一种细胞死亡途径，为凋亡失调的疾病提供了潜在的治疗途径。然而，引发凋亡所需的高浓度和长时间暴露突出了现有化合物的有限效力。在这项研究中，我们介绍了半花菁化合物作为新的麻痹激活剂。其中，化合物2通过与细胞蛋白质中的游离半胱氨酸残基共价相互作用而有效地诱导各种细胞系中的近端下垂，从而引发近端下垂的标志性特征，包括ER的广泛空泡化。通过ABPP分析，我们确定了化合物2的关键蛋白靶点，包括SEC23A和GDI 1，它们与囊泡运输和ER空泡化相关。值得注意的是，化合物2显示出一定程度的选择性，与高度亲核的PDI的相互作用最小，强调了其作为化学探针的潜力。这些发现将化合物2定位为用于开发选择性靶向探针以研究paraptosis的有希望的先导物，其在传统凋亡途径受损的癌症的治疗剂开发中具有潜在的应用。
参考文献
Potent Inducers of Paraptosis through Electronic Tuning of Hemicyanine Electrophiles，Juan F. Tamez-Fernández, Craig F. Steven, Jade Nguyen, and Pablo Rivera-Fuentes*，J. Am. Chem. Soc. 2025, 147, 32571−32579，https://doi.org/10.1021/jacs.5c07109.
