内容提要
本文设计并合成了一种具有聚集诱导发光(AIE)特征的两性PTA(命名为TDTMSB)可进行近红外I/II荧光成像、光声成像、光热成像、I/II型光动力疗法(PDT)-光热疗法(PTT)协同光疗恶性肿瘤。具有螺结构、电子给体-受体构象和独特的AIE性能。TDTMSB具有较长的近红外辐射(延伸到近红外II区)、较大的斯托克斯位移(300 nm)和较小的能隙。同时，它在肿瘤细胞中表现出高的ROSs生成能力(1O2, OH和 O2−)，光热转换效率(高达40.5 %)和对肿瘤细胞的特异性识别。TDTMSB不仅具有出色的多模态成像能力，而且对恶性肿瘤具有I/II型PDT-PTT协同增强作用。
光治疗诊断材料的设计、合成与表征
MSB与三苯胺衍生物分别进行反应，即(4-(N，N-二苯基氨基)苯甲醛、5-(4-(二苯基氨基)苯基)噻吩-2-甲醛和5 '-(4(二苯基氨基)苯基)-[2，2'-联噻吩]-5-甲醛）发生Knoevenagel偶联反应，形成具有稳定双键的螺形目标产物TMSB、TTMSB、TDTMSB。通过研究合成产物在不同乙醇/正己烷比例下的发射光谱，验证了合成产物的AIE性质。随着正己烷分数的增加，观察到荧光强度逐渐增强，这是因为较高的正己烷浓度促进了靶分子的聚集倾向增强。给体上苯环和受体上苯并噻唑的限制性旋转表明目标产物(TMSB、TTMSB和TDTMSB)具有独特的AIE特征。对于TDTMSB分子，当正己烷/乙醇的比例从0 %增加到80 %时，荧光强度逐渐增强。然而，当比率达到90 %时，荧光发射强度显著降低。这主要归因于TDTMSB较大的刚性结构，这促进了聚集的增强，甚至导致一些聚集体的沉淀。与TMSB和TTMSB相比，光学性质更为优越。选择TDTMSB分子用于后续实验。
DTMSB NPs的ROS生成能力及光热效应
本文评估了TDTMSB NPs的ROS产生能力，并利用电子顺磁共振(EPR)光谱法来确定特定的ROS种类。TDTMSB NPs在黑暗条件下没有EPR信号，然而，当在2，2，6，6-四甲基哌啶(TEMP)存在下暴露于白色光4分钟时，EPR分析显示了三个明显的TEMPO形成的等摩尔峰。信号强度随光照时间的延长而增强。将TDTMSB NPs混合的EPR信号与5,5-二甲基-1-吡咯啉氮氧化物(DMPO)在光照射下检测。结果显示出4个峰，强度比为1:2:2:1。TDTMSB NPs与5-叔丁基羰基-5-甲基-1-吡咯啉氮氧化物(BMPO)混合并照射时，观察到6个峰。位置1、2、4、6的峰值强度大致相等，而位置3、5的峰值强度略有降低。EPR结果表明，TDTMSB NPs能产生大量活性氧，包括单线态氧、羟基自由基和超氧自由基。由DCFH探针确定TDTMSB NPs的总ROSs生产效率。结果表明，DCFH组暴露在光照下300 s无明显变化，而RB+DCFH组的相对荧光强度(I/I0)随着光照时间的延长而逐渐增加。辐照300 s后，I/I0值高达18，说明RB可以生成ROSs。TDTMSB NPs + DCFH组的I/I0值在照明90秒后急剧增加到130。随着辐照时间从90 s延长至300 s, I/I0值变化不明显。这些结果表明，与RB剂相比，TDTMSB NPs具有更高的ROSs生成率。同时，我们选择玫瑰红(RB)作为标准剂，通过测定9,10-蒽二基-双(亚甲基)-二丙二酸(ABDA)的衰减率，定量计算了TDTMSB NPs的单线态氧(1O2)产率，生成效率超过80%，超过RB78%。此外，利用红外热成像系统进一步研究了TDTMSB NPs的光热转换效率。在635 nm激光的不同照射强度下，监测了不同浓度的TDTMSB NPs的温度变化。随着TDTMSB NPs浓度的增加和照明功率密度的增加，可以观察到温度显著升高。在浓度为120 μm、光强为0.8 W cm−2的条件下，全面研究了样品的温度变化。在29.3 ℃的室温条件下，测量了TDTMSB NPs和PBS的初始温度。630 nm激光(0.8 W cm−2)照射0 ~ 300 s后，PBS温度在180 s内由29.3℃上升至32.4℃，其余180 ~ 300 s温度变化不显著。
TDTMSB NPs的体外定位及光疗效果测试
利用共聚焦激光扫描显微镜(CLSM)系统研究了TDTMSB NPs的体外荧光成像。采用CLSM进行共定位分析，以确定TDTMSB NPs对亚细胞结构的特异性。实验结果显示，TDTMSB NPs与细胞核标志物(Hoechst33258)、线粒体标志物(Mito-Tracker Green)和脂滴标志物(BODIPY493/503)的荧光信号重叠极小，皮尔逊相关系数分别为1.0%、8.0%和10.0%。这些数据表明，TDTMSB NPs对细胞核、线粒体或脂滴没有特异性亲和力。Lyso-Tracker Green和TDTMSB NPs的荧光信号几乎完全重叠，皮尔逊相关系数高达80.0 %。这些结果表明，TDTMSB进入细胞后会在溶酶体中积累，并实现对溶酶体的精确识别。MDA-MB-231细胞与不同浓度的TDTMSB NPs共同孵育，在避光和光照条件下进行CCK-8实验以评估细胞活力。避光条件下的细胞活性与对照组相比无显著差异。然而，在光照条件下，随着TDTMSB NPs浓度的增加，细胞活力显著下降。在浓度为16 μm时，肿瘤抑制效率超过80%。其次，流式细胞术实验显示，在光照条件下，经TDTMSB NPs处理的MDA-MB-231细胞存活率显著降低，凋亡率较对照组急剧增加至73.6%。为进一步研究TDTMSB NPs的光疗效果，进行了活/死细胞染色实验。对照组中可清晰观察到强烈的绿色荧光信号，这是由于细胞被Calcein AM染色，表明细胞活力良好。在光照条件下，与TDTMSB NPs经碘化丙啶染色后呈现明亮的红色荧光。这种效应主要源于TDTMSB NPs的光激活，导致活性氧(ROS)的产生和大量热量的释放，最终造成MDA-MB-231细胞损伤。此外，为探究TDTMSB NPs的光疗效果，检测了相关凋亡因子(Caspase3、Bax和Bcl-2)的表达。在无光条件下，肿瘤细胞与TDTMSB纳米颗粒共孵育并未使这些凋亡因子发生显著改变。在光照条件下用此类纳米颗粒处理肿瘤细胞，促凋亡蛋白(特别是caspase-3和Bax)的表达呈剂量依赖性上调。相反，随着纳米颗粒浓度的增加，抑制凋亡蛋白bcl-2的表达显著降低。这些结果表明，TDTMSB NPs在光激活下能够调节相关凋亡因子的表达，突显了其强大的光疗效果。
TDTMSB NPs的活体多模态成像与PDT-PTT协同治疗
荧光成像结果显示，在不同时间点(0.5、1、2、4、8、12和24 h)瘤内注射后，通过IVIS系统可清晰观察到BALB/c裸鼠实体瘤中的明亮红色荧光信号。重要的是，在注射后0.5 h记录到最强的荧光强度信号。随着注射时间的增加，红色荧光信号区域持续扩大，但强度减弱。到注射后24 h，红色荧光信号已降至最弱水平。随后，进行光声成像以说明实体瘤的深度穿透能力。研究结果表明，TDTMSB NPs有助于实现高分辨率光声成像，其趋势和特征与荧光成像结果一致。在MDA-MB-231 BALB/c裸鼠瘤内注射TDTMSB NPs后，使用635 nm激光照射10 min进行光热成像。利用红外热像仪定期测定照射区域的温度变化。成像结果显示，激光照射后肿瘤温度从35.7 °C显著升高至60.1 °C。相比之下，PBS处理的小鼠在相同条件下未表现出显著的温度变化，最高达到41.6 °C。这表明TDTMSB NPs具有强大的光热性能，并有望成为一种用于肿瘤光热消融的有前景的光热诊疗剂。使用MDA-MB-231荷瘤BALB/c裸鼠模型评估TDTMSB NPs的体内PDT-PTT治疗效果。小鼠用PBS和TDTMSB NPs(100 μL)处理1小时，然后用635 nm激光(300 mW cm⁻²)照射10分钟，进行7次循环。经PBS、PBS+激光以及TDTMSB NPs处理的荷瘤小鼠，其肿瘤体积逐渐增大，表明对肿瘤生长无抑制作用。然而，经TDTMSB NPs联合激光处理的MDA-MB-231荷瘤小鼠情况显著改善。肿瘤体积逐渐缩小，部分肿瘤完全结痂或消失。此外，治疗15天后，收集所有荷瘤小鼠的实体瘤并记录其大小。与其他组相比，总肿瘤体积显著减小，表明TDTMSB NPs对MDA-MB-231恶性肿瘤具有优异的抑制作用。这些结果主要归因于TDTMSB NPs在激光照射下产生的大量活性氧以及光热效应。
结论
本文设计并便捷合成了一种多功能两性AIE光诊疗系统，以实现恶性肿瘤"3+2"协同光诊疗模式。该系统包括近红外I/II区荧光成像、光声成像、光热成像以及影像引导的I/II型PDT-PTT协同光疗。目标化合物具有巧妙的转子扭曲结构、D-A构象和独特的AIE特性。体外实验表明，TDTMSB NPs在浓度高达80 μm时无细胞毒性，具有良好的荧光成像性能，并对肿瘤生长表现出优异的抑制作用。在光照条件下，它可以调节促凋亡因子和抑制凋亡因子的表达。体内研究表明TDTMSB NPs能够实现多模态成像，包括近红外I/II区荧光成像、光声成像和光热成像。
参考文献
A “3+2” Cooperation Pattern of Amphipathic AIE Phototheranostic System for Multimodal Image-Guided Synergistic Type I/II Photodynamic-Photothermal Therapy, Haijun Ma, Yibo An, Yuanyuan Han, Feifan Zhao, Yunfei Zuo, Guokang He, Zhixiang Lu,*Ryan T. K. Kwok,* Jianwei Sun, Jacky W. Y. Lam, Yen Wei,* and Ben Zhong Tang*, Adv. Sci. 2025, e07956. https://doi.org/10.1002/advs.202507956
