内容提要
本文巧妙地构建了一种新型双响应荧光探针 TDPP，该探针基于 TICT 和 ICT 机制，对粘度和 ONOO- 具有卓越的灵敏度和选择性。荧光成像显示，探针 TDPP 具有线粒体靶向性，可检测粘度和 ONOO- 的变化。此外，TDPP首次通过同时监测粘度和ONOO-的变化，探索了AKI和铁蛋白沉积过程，并表明铁蛋白沉积抑制剂（Fer-1）和白藜芦醇（Res）可通过抑制体外和体内的铁蛋白沉积来缓解AKI，这表明铁蛋白沉积对AKI具有重要的治疗价值。
结果和讨论
TDPP 的设计以及对粘度响应的光谱特性
三苯胺（电子供体，D）和吡啶鎓盐与二苯基硫代磷酰（电子受体，A）通过双碳-碳键（π桥）连接，构建出经典的 "供体-π-受体（D-π-A）"，从而获得 TDPP。目标分子利用三苯胺（TPA）和吡啶鎓盐作为转子，对粘度非常敏感。在高粘度环境中，它表现出强烈的荧光。同时，引入了吡啶阳离子，通过与电负性线粒体的静电相互作用，有效地靶向线粒体，从而使 TDPP 具有良好的生物相容性和低毒性。此外，TDPP 还含有一种具有 AIE 活性的 TPA，可防止聚集引起的淬灭（ACQ），使其在生物成像和分析方面大有可为。在含有 0-100 % 不同甘油体积分数的甲醇中研究了 TDPP 的粘度响应行为。所示，当甘油含量增加并导致粘度升高时，我们观察到 TDPP 荧光强度逐渐升高。这种增强是由于供电子基团和吸电子基团之间的分子内旋转有限，从而促进了 TICT 效应。此外，在 0-90 % 的范围内，荧光强度的对数（log I624）与甘油含量呈线性关系（R2 = 0.9882），这意味着 TDPP 对粘度的变化具有相对灵敏的监测能力。在水-甘油体系中，随着甘油含量的增加，TDPP 也表现出类似的特性。此外，还选择了各种极性溶剂，包括 H2O、DMSO、乙醇、DMF、甲醇、乙腈和甘油，研究它们对 TDPP 紫外可见光/荧光光谱的影响。研究结果表明，TDPP 的荧光信号在甘油中最强（Φf = 0.45），这表明其对溶液极性不敏感，对溶液粘度具有高选择性。
TDPP 对 ONOO- 响应的光谱特性
为了评估 TDPP 对 ONOO-的敏感性，分别测量了经 ONOO-处理和未经 ONOO-处理的紫外可见光/荧光光谱。观察到吸收峰从 474 nm 蓝移到 378 nm，颜色从橙色变为淡黄色，同时在 546 nm 处检测到强荧光（Φf = 0.248）。随后，我们进行了荧光滴定实验，观察到 546 nm 处的发射峰呈浓度依赖性增长，表明 TDPP 能够识别 ONOO-。此外，在 2-16 μmol/L 范围内，TDPP（I546）的荧光强度与 ONOO- 呈高度线性响应（R2 = 0.9912）。根据 LOD = 3σ/k 公式，最低检测限被确定为 9.56 nM，远低于之前报道的 ONOO-荧光探针。此外，我们还评估了 TDPP 对 ONOO-的反应时间。，随着 ONOO-孵育时间的延长，TDPP 的荧光强度逐渐增加，并在 600 s时达到最大值，表明其响应时间为 600 s。为了研究 TDPP 对 ONOO- 的特异性，我们研究了 TDPP 暴露于各种常见干扰物质（Cu2+、Fe2+、Na+、Cr3+、Sn2+、Zn2+、NH4+、CO32-、HCO3-、MnO4-、S2O32-、HSO3-、S2-、KO2、NaClO、H2O2、GSH、Cys、Hcy、Arg、ONOO-）后的荧光光谱。加入其他活性分析物（100 μM）对荧光强度影响不大，而加入 ONOO- 时荧光强度显著增加，这表明 TDPP 对 ONOO- 具有高选择性。此外，当其他物质与 ONOO- 共存时，荧光强度仍然明显增强，反映出 TDPP 对 ONOO-的检测不受其他物质的影响。因此，探针 TDPP 具有很好的抗干扰能力。为了探索 TDPP 对 ONOO-的最佳 pH 值范围，研究了 TDPP 在不同 pH 值条件下（pH 3-10）的荧光光谱。加入 ONOO-后，探针本身没有明显变化，但荧光强度明显增强，并在 546 nm处保持不变。此外，还研究了温度对 TDPP 对 ONOO-反应性的影响。在很宽的温度范围内（27-42°C），TDPP 几乎可以忽略不计地保持荧光，而在暴露于 ONOO-时则表现出显著的荧光增强。这些结果表明 TDPP 具有在复杂环境中检测 ONOO- 和识别体内 ONOO-的潜力。
TDPP 对粘度和 ONOO- 的细胞成像
基于 TDPP 卓越的光谱特性，我们对其细胞成像进行了研究。所有细胞都表现出较高的存活率，当浓度达到 20 μM 时，存活率高达 80%，这表明 TDPP 具有良好的生物相容性，具有应用于生物成像的潜力。此外，还对 TDPP 在指定时间内的细胞内吸收情况进行了评估。与 TDPP 培养 30 分钟后，黄色和红色通道的荧光强度最强，表明细胞成像的合适时间为 30 分钟。然后，由于 TDPP 含有吡啶阳离子单元，我们通过与线粒体商用染料 MitoTracker Green 共同孵育来评估 TDPP 的定位。观察发现，绿色荧光图和红色荧光图重叠，皮尔逊共定位系数为 0.989，这表明 TDPP 主要位于细胞的线粒体中。在 MCF-7 细胞中也发现了类似的结果
为了探索 TDPP 检测活细胞粘度的能力，我们采用了低温，因为细胞内粘度在低温下会增强。因此，在不同温度下培养 293 T 细胞，然后使用 TDPP 检测粘度波动。，由于细胞内粘度最高，4 ℃ 的红色荧光信号比 25 ℃ 和 37 ℃ 的最强。此外，由于奈司他丁（Nys）可导致线粒体功能障碍，从而提高线粒体粘度，因此选择了奈司他丁（Nys）与细胞培养。随着预处理时间的延长，红色荧光强度逐渐增强，验证了 TDPP 的红色荧光信号与粘度呈正相关。因此，TDPP 可用于评估体外粘度波动。我们还评估了 TDPP 显示细胞中外源性/内源性 ONOO-的能力。仅用 TDPP 预处理的 293 T 细胞显示出微弱的黄色荧光，而加入 ONOO-后荧光明显增强。黄色荧光信号随着 ONOO-浓度和预处理时间的增加而增强。此外，其红色荧光低于对照组，与文献报道一致。随后，用脂多糖（LPS）刺激 293 T 细胞，促使细胞产生内源性 ONOO-。不出所料，与对照组相比，LPS 刺激后黄色荧光强度显著增强。相反，在 LPS 和尿酸（一种 ONOO-抑制剂）共同处理的细胞中，荧光信号减弱。上述结果表明，TDPP 可以在体外成像外源性/内源性 ONOO-的变化。我们研究了正常细胞（293 T）和癌细胞（MDA-MB-231、MCF-7）之间 TDPP 线粒体荧光强度的变化。结果表明，癌细胞 MDA-MB-231 和 MCF-7 的黄道和红道荧光强度均强于正常细胞 293 T，分别是 293 T 细胞的 5.59/9.43 倍和 2.15/2.92 倍，这表明癌细胞线粒体粘度高，ONOO-较多。因此，TDPP 具有通过单一粘度或 ONOO-探针区分正常细胞和癌细胞的能力，但双通道同时验证可提供更精确的结果。此外，在 293 T、MDA-MB-231 和 MCF-7 细胞和基于 4T1 细胞的三维多细胞球体中进行的三维图像实验表明，TDPP 具有出色的穿透性，尤其是在癌细胞中。
结论
我们成功地构建了一种双功能荧光探针 TDPP，它可以同时独立地对线粒体中的 ONOO- 和粘度进行成像，从而为评估铁变态反应在 AKI 中的作用提供了一种有效的工具。光谱实验表明，TDPP 对粘度和 ONOO- 具有极佳的选择性和灵敏度。由于 TDPP 具有良好的生物相容性，生物成像实验首次证实，在细胞水平和小鼠模型中，ONOO- 和粘度在铁氧化和 AKI 期间升高。值得注意的是，铁突变抑制剂 Fer-1 和天然多酚 Res 能有效缓解顺铂诱导的损伤，这表明抑制铁突变可能是缓解 AKI 的潜在途径。此外，研究还阐明了 AKI 中 ONOO- 生成的信号通路，这为揭示铁嗜酸参与 AKI 提供了重要见解。总之，这项研究首次通过检测 ONOO- 和粘度探讨了铁氧化与 AKI 之间的关联，为早期检测和干预 AKI 提供了新的视角。
参考文献
A dual-responsive fluorescent probe for detecting ONOO- and viscosity fluctuations in vivo during ferroptosis-mediated acute kidney injury Chen-Chen Li , Ya-Li Meng ， Jun-Tao Niu , Can Liu , Li Wang , Ting Liang , Xiao-Juan Jia , Xu-Ying Liu ,*, Yan-Fei Kang ,* 2026, 447 , 138786. https://doi.org/10.1016/j.snb.2025.138786.
