内容提要
本文开发一种荧光传感和标记策略来准确获取O2·−上的时空信息。该荧光探针可与O2·−反应，引发与附近生物亲核性分子结合的共价荧光标记的产生。这一作用有助于线粒体功能障碍时O2·−的高精度原位成像。，应激敏感小鼠海马神经元中树突棘密度降低，同时线粒体O2·−依赖的线粒体外周分裂显著增加。我们进一步确定了抑郁症相关的病理级联反应，首先是海马神经元中钙离子水平的升高，这触发了依赖mtO2·−的辅酶Q4的减少和Parkin的升高，驱动了线粒体外周分裂，降低了突触的可塑性。
结果与讨论
RB-FM的设计、合成及光学性质
为了研究mtO2·−是否调节线粒体损伤，有必要准确地捕捉线粒体功能障碍过程中O2·−的时空变化。这一策略利用荧光产物可以与蛋白质永久连接的事实，从而抵消了原位探针的扩散，从而能够准确地测量O2·−的定位，并有助于精确检测特定亚细胞区域的O2·−通量。mtO2·−的快速波动需要能够立即做出反应的探针。因此，我们选择三氟甲基磺酰基作为O2·−的特异性识别基团。为了满足上述要求，染料需要具有优异的光物理性能和多个形态可修饰的位点。与O2·−反应后，三氟甲基磺酰转化为相应的苯酚可引发氟化物的消除，生成高活性的甲基苯醌电泳液。当在细胞内形成时，这种电泳体与近端基于蛋白质的亲核试剂反应，在基于活性的传感反应的位置产生共价标记的荧光产物。简而言之，首先在二氢呋喃的羟基附近引入一个醛基团。随后，三氟甲基磺酰被连接到羟基位置。然后，通过还原和氟化反应将醛基团转化为苄基氟化物，得到荧光探针RB-FM。为了验证Rb-FM的空间标记能力，我们还制备了对照探针Rb-SA(缺少苄基氟化物结构)和活化探针Rb-FM-SA。在制备了RB-FM探针后，我们测试了它的光学性质。Rb-FM在568 nm处有吸收峰，在615 nm处有荧光峰，在5 S内与O2·−反应后，荧光峰增加。O2·−浓度在0~1.0μΜ范围内，Rb-FM对O2·−的剂量依赖性响应符合线性回归方程F615 nm=3898.8[O2·−](μM]+14.205，相关系数为0.996，检出限为0.75nΜ。当O2·−的浓度不断增加时，探针的荧光强度增加，逐渐达到一个平台(在∼5μM)。此外，RB-FM对O2·−产生了对其他生物相关的ROS、金属离子和亲核剂的高度选择性反应，在pH从6.5%到9.0时不受影响。此外，RB-FM还具有优异的光稳定性。这些结果表明，该探针对O2·−具有卓越的灵敏度和选择性。
RB-FM的空间标注性能
为了测试Rb-FM在O2·−依赖下的空间标记性能，我们将Rb-FM或Rb-SA与牛血清白蛋白(BSA)在O2·−(0−1.0μM)存在或不存在的情况下孵育，并用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳法分析反应。观察到只有与探针Rb-FM孵育会导致蛋白质带的荧光强度增加，而与探针Rb-SA孵育不会增加蛋白质带的荧光强度。这表明Rb-FM中的苄基氟化物部分对于实现对O2·−响应的蛋白质的共价标记是至关重要的。为了更好地模拟在活体系统中产生O2·−的生理条件，利用黄嘌呤氧化酶(XO)作为O2·−的来源。当与黄嘌呤和XO共同孵育时，RB-FM触发XO的荧光共价标记，而超氧化物歧化酶(SOD)的加入使其减弱。此外，在XO和BSA存在的情况下，RBFM选择性地标记XO。此外，还进行了高分辨率LC-MS实验，以证实所提出的荧光传感和标记机制。Rb-FM(tr=3.461分钟，[M+H]+，m/z=602.1257)和Rb-FM+O2·−的LC MS显示Rb-FM与相关苯酚发生裂解(tr=2.003分钟，[M]+，m/z=468.1799)。这些结果表明，探针rBFM在响应O2·−后，可以快速实现相邻蛋白质的荧光共价标记。
Rb-FM可获得活神经元线粒体O2·−的时空信息
在使用RB-FM对生物体系中的O2·−进行成像之前，用CCK-8法评价其细胞毒性。结果表明，RB-FM在50μM的浓度下表现出良好的生物相容性，高于用于成像的RB-FM(10μM)。接下来，我们检查了该探针在活神经元中成像O2·−的能力。以往的研究表明，谷氨酸(Glu)是一种主要的内源性兴奋性神经递质，促进正常的突触传递和可塑性。然而，Glu浓度升高可过度刺激谷氨酸能受体，导致钙内流和蛋白激酶C(PKC)易位，最终导致氧化爆发和氧化应激。为了启动氧化应激，原代神经元被100μM Glu预处理1h，这些神经元产生比对照神经元更亮的荧光(约3倍)。为了进一步证实探针荧光强度的增强可归因于神经元内O2·−浓度的升高，我们将Glus刺激的原代神经元与O2·−的特异性清除剂TIRON孵育，发现与没有TIRON的原代神经元相比，荧光强度显著抑制(2.7%)。这些结果表明，Rb-FM探针可以特异性地显示原代神经元O2·−水平的变化。此外，在PC12细胞中验证了RB-FM成像内源性O2·−的能力。我们观察到Rb-FM很可能在线粒体中积累。为了确定Rb-FM的准确位置，我们将原代神经元与MitoTracker Green和Rb-FM共同孵育。如图所示，用100倍油浸物镜观察到清晰的线粒体结构，RB-FM的荧光与MitoTracker Green的荧光显示出强烈的重叠，皮尔逊系数为0.85。这可能是由于线粒体是神经元产生ROS的主要细胞器。为了进一步验证探针RB-FM通过共价蛋白标记实现对线粒体O2·−的时空示踪，而不是通过静电相互作用实现线粒体的活化形式聚集(RB-FM-SA)，我们用RB-FA-SA进行了细胞成像。结果显示，RB-FM-SA缺乏有效的线粒体定位(皮尔逊系数：0.42)。此外，Rb-SA和Rb-FM显示出不同的亚细胞分布。此外，与Rb-SA成像不同，Rb-FM的荧光强度在广泛洗涤或线粒体膜电位(MMP)消散后保持不变。这些数据表明，RB-FM共价标记线粒体以响应O2·−。值得注意的是，与MitoTracker Green不同，MitoTracker Green统一标记细胞中的所有线粒体，而探针RB-FM在单个线粒体甚至单个线粒体的亚域内显示出不同的荧光强度。这些发现使我们能够获得线粒体损伤过程中O2·−的精确时空信息。
应激敏感小鼠海马线粒体mtO2·−升高与线粒体外周分裂
我们观察了抑郁小鼠海马神经元线粒体O2·−水平的时空变化。首先，C57BL/6J雄性小鼠接受连续28天的慢性不可预测温和应激(CUMS)，然后根据抑郁样行为的测量将其分为应激敏感组和弹性组(SS和SR)。随后，通过高尔基染色评估每组小鼠的海马树突状可塑性。如图所示，在对应激敏感的小鼠中，海马区神经元树突棘的密度显著降低。这促使我们调查海马体的这些变化是否与mtO2·−有关。为了评估这一点，我们使用RB-FM对不同组的海马区mtO2·−进行了成像。与对照组相比，应激敏感组和应激恢复组的海马片的荧光强度分别增加了8倍和2倍。这表明应激敏感小鼠海马区mtO2·−显著升高。线粒体O2·−的升高反映了线粒体正在经历氧化应激的事实，这可能导致线粒体的损伤。因此，我们通过检测两个关键指标--海马线粒体内的线粒体膜电位和三磷酸腺苷水平来评估线粒体的状态。我们发现，与对照组相比，应激恢复组和应激敏感组的线粒体膜电位分别下降了14%和20%。此外，与对照组相比，ATP水平分别下降了10%和60%，表明线粒体受损。
线粒体外周分裂表现出O2·−依赖性
为了进一步研究O2·−与海马区线粒体分裂的关系，以及由此导致的突触可塑性降低，我们首先研究了O2·−升高对线粒体的影响。谷氨酸孵育导致线粒体O2·−升高，线粒体膜电位降低。相反，应用MitoTEMPO(一种线粒体靶向O2·−清除剂)可以恢复谷氨酸孵育引起的线粒体膜电位下降。提示O2·−升高可能导致线粒体内线粒体膜电位降低，进而导致线粒体损伤。我们进一步探讨了O2·−升高对线粒体形态的影响。MitoTracker Deep Red长时间动态成像显示，Glu孵育后线粒体明显肿胀和碎裂，并出现线粒体外周分裂。重要的是，这种碎裂也同样通过清除mtO2·−而得到缓解。为了获得更直接的证据，我们使用RB-FM探针动态观察了mtO2·−和神经元形态的协同变化。我们发现，线粒体O2·−水平的升高引发了线粒体外周分裂。这些结果表明线粒体外周分裂依赖于mtO2·−。为了确定O2·−升高所介导的线粒体外周分裂是否影响神经元突触的可塑性，我们观察了谷氨酸孵育过程中神经元树突棘的形态变化。结果发现，Glu孵育显著改变了树突棘密度，而未暴露于Glu的神经元在同一时间段内树突棘密度没有显著变化。在Glu孵育过程中，用MitoTEMPO清除O2·−也可以防止Glug诱导的树突棘密度的变化。这些结果表明，应激敏感小鼠海马区高浓度的mtO2·−介导了线粒体外周分裂水平的增加和神经元突触可塑性的降低。
结论
mtO2·−可能通过介导海马神经元线粒体损伤而参与抑郁症的发生，建立其动态变化与线粒体结构和功能改变之间的时空联系对于阐明特定的病理机制至关重要。为了解决这一问题，我们首次开发了一种荧光传感和标记策略来精确捕获O2·−的时空信息。该荧光成像探针(RB-FM)能在5 S内与O2·−发生快速反应，灵敏度高(检出限：0.75 nm)，引发与附近生物亲核试剂的共价荧光标记。这有助于在线粒体损伤期间高精度地原位成像O2·−，以及应激敏感小鼠海马神经元突触可塑性的变化。值得注意的是，我们在应激敏感小鼠的海马神经元中发现了一种有趣的线粒体损伤形式：线粒体O2·−驱动的线粒体外周分裂显著增加，而总体线粒体分裂和有丝分裂保持不变。我们进一步发现了一个与抑郁相关的级联通路，在该通路中，应激敏感小鼠海马区钙水平升高导致mtO2·−增加，线粒体相关蛋白异常表达，最终导致线粒体外周分裂，从而导致突触可塑性受损。
参考文献
Superoxide Anion-Dependent Mitochondrial Fission Contributes to HippocampalSynaptic Dysfunction in Stress-Susceptible Mice.Xiwei Li,Xue Xue,Simiao Zhang,Tony D.James,Ping Li,Xin Wang and Bo Tang.JACS Au 2025,https://doi.org/10.1021/jacsau.5c00493.
