内容摘要
我们基于苯基活化酯与伯胺之间的亲核取代反应开发了一系列精氨酸探针（Rap1−9）。其中，优化后的近红外发射比率型荧光探针Rap-9在其反应位点表现出最强的亲电性，能够实现体外和体内精氨酸的快速、特异性检测。
Rap1−9探针的设计与筛选
为了设计出一种高性能的精氨酸（Arg）探针，使其具有出色的特异性、灵敏度、时间分辨率和比率荧光响应，我们在Rap-9中引入了三氟苯甲酸酯作为识别基团，通过精氨酸N端α-氨基的亲核取代作用特异性识别精氨酸。其次，从调节探针识别基团活性的角度来看，在酯基上引入各种给电子基团（EDG）和吸电子基团（EWG）会改变羰基碳上的电子分布，从而进一步精细地控制反应活性。同时，选择半花青衍生物作为荧光团，这类荧光团具有光损伤低、组织穿透力强和信噪比高的优点。
为了验证我们探针的分子设计原理，系统地进行了全面的密度泛函理论（DFT）计算。如图2c所示，对Rap1−9的静电势（ESP）分布分析表明，最大静电势集中在苯基活化酯部分。这种独特的电子结构表明，苯基活化酯位点对亲核攻击的敏感性更高，这与它在分子识别过程中的主要反应中心作用相符。我们对Rap-9进行了系统的HOMO−LUMO能量计算。结果表明，探针Rap-9在该系列中具有最负的LUMO能量（−2.9374eV），从而证实了其对精氨酸伯胺官能团亲核攻击的优越反应活性。对探针Rap1−9对精氨酸的选择性响应进行了系统评估。探针Rap1−8与赖氨酸和组氨酸存在明显的交叉反应。相比之下，探针Rap-9显示出极佳的特异性。
探针Rap-9与它们反应的时间依赖性荧光实验结果见图；只有精氨酸迅速导致685纳米处的荧光强度显著减弱，而其他物质引起的荧光变化可忽略不计。特别是，Rap-8在10分钟内受到赖氨酸/组氨酸的显著干扰（>40%），而Rap-9对精氨酸则保持了特异性反应。这进一步证明了Rap-9与精氨酸的反应并非由非特异性引起。研究表明，在与赖氨酸、甘氨酸、组氨酸、半胱氨酸、胍或N-乙酰精氨酸孵育后，与探针Rap-9相对应的峰保持不变，且未检测到Rap−OH的形成。相反，与精氨酸孵育后，Rap-9的峰完全消失，并出现了一个与Rap−OH相对应的新的峰，表明在测试条件下Rap-9选择性地与精氨酸反应。这些HPLC轨迹提供了直接证据，表明在Rap-9存在的情况下，其他氨基酸和生物相关的胺未发生反应，从而支持了所开发探针对于精氨酸的高度选择性。精氨酸（Arg）的胍基团并未表现出反应性，而是使α-氨基保持足够的去质子化状态，从而能够进行亲核攻击；（2）Rap-9中的活化酯基团含有三氟苯甲酸酯基团，具有很强的亲电性，能选择性地与可接近的一级胺反应。该探针的结构设计促进了对精氨酸N端α-氨基的选择性识别和反应，而非其他生物分子中的侧链或硫醇；（3）精氨酸的带正电的胍基团可能与部分带负电的羰基氧（Rap-9的δ−)基团）形成较强的静电相互作用，通过有利的非共价相互作用增强α-氨基的局部反应性。因此，这种分子排列促进了四面体中间体的形成，从而实现了Rap-9与精氨酸之间的高效反应。
Rap-9的光物理性质研究
Rap-9的F755/F685比值与精氨酸浓度（0.5至160微摩尔）之间呈现出良好的线性相关性（R2=0.9986）。回归方程估计为F755/F⏭=0.54+0.063[精氨酸]微摩尔，检测限（LOD）为0.13±0.015微摩尔，并实现了3.6±0.04秒的快速响应时间。此外，当在685纳米处照射2.5小时时，无论有无精氨酸，探针Rap-9均表现出良好的长期光稳定性，荧光变化小于4.5%。这些结果突显了Rap-9在生物环境中实时准确检测精氨酸的稳健性和可靠性。
神经干细胞中精氨酸的荧光成像以及在O2‑-stimulated神经干细胞分化中的调节作用
为了将探针Rap-9应用于生物系统中精氨酸的检测，通过3-（4,5-二甲基噻唑-2-基）-2,5-二苯基四氮唑溴盐（MTT）测定法和流式细胞术（FACS）评估了探针Rap-9的生物相容性和细胞毒性。将不同浓度（0、5、10、15、20和30μM）的探针Rap-9与神经干细胞共同孵育12和24小时，细胞存活率均在90%以上。同时，在FACS实验中，用不同浓度（0、10、20和30μM）的探针Rap-9孵育24小时后，存活神经元的百分比仍保持在94%以上。这些结果表明探针Rap-9对神经干细胞具有良好的生物相容性和低细胞毒性。基于这些发现，我们继续研究了Rap-9在神经干细胞中的靶向特异性和代谢稳定性。为了阐明亚细胞定位，我们使用探针Rap-9与商业化的细胞器选择性示踪剂进行了共定位研究。探针Rap-9的F685和F755通道的荧光信号与MitoTrackerGreenFM（MTG）染料的荧光信号重叠良好。长期暴露于高氧化应激条件下会促进静息态神经干细胞（qNSC）激活为活跃态神经干细胞（aNSCs），从而启动从维持干细胞特性到神经元分化的表型转变。我们进一步量化了在O2−刺激神经干细胞分化过程中精氨酸（Arg）的变化情况，结果表明，在用不同浓度的O2−刺激qNSCs后，qNSCs中F685通道的荧光强度逐渐降低，而F755通道的荧光强度显著增加，这表明在O2−(的刺激下，qNSCs内源性精氨酸的浓度从5.11±1.00增加到14.48±0.77。形态学分析显示qNSC细胞结构发生了连续的转变：细胞逐渐从圆形形态转变为具有丰富突触结构的细长细胞形状。此外，在N-乙酰半胱氨酸（NAC，一种抗氧化剂）存在的情况下，用O2−(50μM刺激qNSCs后，观察到qNSCs的分化比例显著降低。随后的免疫荧光分析阐明了qNSC群体的分化轨迹和分化效率。用50μM的O2−处理后，神经元标志物微管相关蛋白2（MAP2）的表达量相对于星形胶质细胞标志物胶质纤维酸性蛋白（GFAP）上调了7.9±0.14倍，从而确立了最佳的神经发生分化。同样，在NAC存在的情况下用O2−(50μM刺激qNSCs后，qNSCs的分化效率显著降低。这些综合结果明确表明，O2−treatment能够有效激活qNSCs并引导其优先分化为神经元谱系。
结论
我们提出了一种近红外发射比率型荧光探针，通过亲核取代反应调节酯基反应位点的活性，从而实现对精氨酸的特异性识别。优化后的 Rap-9 探针在体外和体内对精氨酸均表现出高特异性和高灵敏度，并且由于其强亲电性，响应时间仅为 3.6 ± 0.04 秒。我们进一步利用开发的 Rap-9 探针研究了在神经干细胞（NSCs）分化过程中精氨酸的实时监测和精确定量。结果表明，精氨酸浓度的调节通过诱导 NSCs 向神经元分化发挥了作用。蛋白质组学实验进一步揭示，精氨酸介导的 mTORC1 信号通路的激活对于 NSCs 向神经元的分化至关重要。这项工作成功开发了一种可靠的工具，用于精氨酸的实时成像和精确定量，这种分子识别的设计策略也可合理地扩展到其他氨基酸。此外，对精氨酸在神经干细胞分化过程中所起作用的更深入理解为多种神经系统疾病的治疗提供了新的策略和希望。
参考文献
Lighting Up Arginine Metabolism Dynamics in Neural Differentiation through Ratiometric Fluorescence Imaging，JinYan, YuxiaoMei,*YudanZhao, YangTian* J. Am. Chem. Soc. 2025, 147, 34350−34360. DOI: 10.1021/jacs.5c05685.
