内容提要
我们确定了带有羟甲基基团（HMDER）的对甲氨基酚作为设计各种水解酶荧光探针的合适支架。 HMDER在生理pH下显示出强荧光，但HMDER的酚O-烷基化导致强烈偏爱螺环形式，其荧光较弱。我们利用这一发现开发了一种新的 β-半乳糖苷酶荧光探针。 该探针在生物样品成像方面具有良好的特性：具有良好的细胞渗透性，水解产物在细胞内保留良好。
罗丹明衍生物的羧酸基转化为硫代甲基或氨甲酰基可以稳定螺环结构，这一现象已被用于控制反应前后的荧光，如次氯酸和阳离子。还已知转化为羟甲基在非常基本的条件下诱导二氯荧光素螺旋环的形成，但不在生理pH范围内。由于到目前为止对羟甲基对包括罗多尔衍生物在内的其他荧光团的荧光性质的影响知之甚少，我们初步制备了羟甲基DER(HMDER)，并通过比较吸光度和荧光DER和HMDER的pH曲线来考察羟甲基的影响。测得HMDER的酚羟基的pKa为5.4，与DER的pKa相近。PH 10以上吸收降低的原因可以解释为一种非荧光螺环形式的参与。在本文中，我们将pKCycl值定义为化合物的吸光度由于螺环作用而下降到最大吸光度的一半的pH值。HMDER的pKCycl值被确定为11.3。相比之下，HMDER的甲醚衍生物(HMDER-Me)的pKcycl为6.6。有趣的是，有趣的是，在〜7.4的生理pH值下，HMDER以有色和荧光的开放形式存在，而HMDER-Me以无色非荧光螺环形式（85％）和弱荧光开放形式（15％）之间的平衡存在。 这些结果表明，在生理pH下，羟甲基稳定了HMDER-Me的螺环形式，但不能稳定HMDER。 我们认为，HMDER 和 HMDER-Me 的 pKcycl 值的显着差异可能是由于它们的还原电位差异所致，可用于设计基于对甲氨基酚的β-半乳糖苷酶探针。也就是说，在HMDER的酚羟基上掺入酶反应部分将导致通过螺环形成抑制背景荧光，而与酶的反应将产生荧光HMDER。我们通过将β-吡喃半乳糖苷基团合并到 HMDER中来合成 HMDER-βGal。我们检查了HMDERβGal的pH曲线和荧光特性，得到了 6.9 的pKcycl 值，这意味着它在 pH 7.4 时以螺环形式(75%)和开放形式 (25%)之间的平衡存在，类似于 HMDER-Me 的情况。螺环形式在可见光波长范围内没有吸收/荧光，而小开放形式仅显示微弱的荧光（Φfl = 0.009）。相比之下，HMDER主要以开放形式存在，显示出相对较强的荧光（Φfl = 0.141）。由于这些效应，与 β-半乳糖苷酶反应后，观察到荧光增加高达 76 倍。接下来我们检查了这种新探针是否可以可视化活细胞中的β-半乳糖苷酶活性。当 HEK/lacZ 细胞与 10μM HMDER-βGal溶液一起培养时，我们观察到细胞内明显的荧光增加，而对于不表达 β-半乳糖苷酶的HEK 细胞没有观察到明显的荧光增加。与TG-βGal获得的荧光信号相比，HMDER-βGal获得的信号被限制在细胞内，周围信号被抑制到较低水平，使我们能够实现高对比度成像。我们进一步检查了 HMDER-βGal 产生的荧光信号的亚细胞定位，发现裂解的染料倾向于主要在内质网和部分高尔基体中积累，而酶则在细胞质中广泛表达。此外，用ALOGPS 2.1程序计算出的logP（分配系数的对数）值，HMDER-βGal（螺环型）为2.88±0.85，TG-βGal为1.76±0.68，而通过HPLC法测定pH7.4时的logD值为HMDER-βGal为2.0，TG-βGal为1.1。在这两种情况下，HMDER-βGal 的值都比 TG-βGal 大 1个单位，表明 HMDER-βGal 应该具有改善的细胞通透性。我们还使用 MTT测定检查了 HMDER-βGal 的细胞毒性，并观察到浓度高达100μM时没有细胞毒性作用。
我们尝试可视化果蝇组织中的β-半乳糖苷酶活性，果蝇是遗传研究中最常用的模型生物之一。我们使用取自三龄幼虫的翼盘（翅膀的前体结构），其中 β-半乳糖苷酶（用作标记酶）仅在后部区域表达。在开始用 HMDER-βGal 孵育组织后不久，仅在 β-半乳糖苷酶表达区域观察到明显的荧光增加。 荧光增加的速度非常快，只需几分钟即可获得图像。通过常规X-Gal染色证实β-半乳糖苷酶的表达，结果表明荧光信号与β-半乳糖苷酶活性共定位。相反，当使用不表达β-半乳糖苷酶的翼盘时，没有明显的荧光增加。 总之，我们设计、合成并评估了HMDER-βGal，一种新型β-半乳糖苷酶荧光探针。 据我们所知，这是首次证明羟甲基的螺环化可以有效地用于控制在生理pH下与目标酶反应之前/之后的荧光发射。 此外，我们使用对甲氨基酚支架导致探针的细胞积累增加，使我们能够对活细胞和黑腹果蝇组织中的β-半乳糖苷酶活性进行清晰的原位可视化。由于β-半乳糖苷酶是生物学研究中使用最广泛的报告酶之一，因此这种新探针的潜在应用范围将是巨大的。最后，应该很容易扩展这种简单但有效的设计策略，其中涉及HMDER酚羟基的功能化，以开发针对各种目标分子的荧光探针，例如其他糖苷酶（例如唾液酸酶/甘露糖苷酶）、酯酶和活性氧。这种探针将成为生物学研究的强大工具。
参考文献
β-Galactosidase Fluorescence Probe with Improved Cellular Accumulation Based on a Spirocyclized Rhodol Scaffold,Mako Kamiya , Daisuke Asanuma , Erina Kuranaga , Asuka Takeishi , Masayo Sakabe , Masayuki Miura , Tetsuo Nagano,Yasuteru Urano，J. Am. Chem. Soc.，2011,133, 12960-12963.https://doi.org/10.1021/ja204781t
