内容提要
肝纤维化（HF）是一种主要由慢性炎症和损伤引起的渐进性瘢痕形成过程，可导致肝衰竭、肝硬化和肝细胞癌等严重并发症。早期诊断和有效治疗可以预防并发症。除了缺乏早期诊断的方法外，治疗药物无法以可控的方式给药，导致药物的生物分布不均匀，副作用明显，最终无法达到理想的治疗效果。最近的一些研究发现，在各类肝病的早期阶段，酯酶水平会出现明显异常。因此，我们希望开发一种酯酶激活的给药荧光系统，以实现高频疾病的靶向诊断和可视化给药。在这项工作中，我们设计了一种荧光原药（HC-Cl-UDCA），通过酯键将近红外（NIR）氯化半氰基荧光团与熊去氧胆酸（治疗肝病的一线药物）连接起来。HC-Cl-UDCA 可被肝脏中的酯酶迅速激活（< 100 秒），释放出近红外荧光信号和治疗药物 UDCA。最重要的是，我们在一周的高频小鼠模型中实现了早期诊断，并证明了药物在肝脏中的良好保留能力。据我们所知，这是首个酯酶驱动的用于高血脂治疗的荧光原药。
结果和讨论
HC-Cl-UDCA 的设计与合成
最初，我们选择了半氰基（HC-OH）作为信号报告物，因为它具有近红外发射、高荧光量子产率和良好的可修改性。然而，我们发现 HC-OH 的生物相容性较差（在 20 μM 培养条件下，L02 细胞的存活率低于 30%）。为了解决这个问题，我们在 HC-OH 的羟基正交位置引入了一个氯原子，合成了 HC-Cl-OH。结果表明，HC-Cl-OH 具有良好的生物相容性（浓度为 20 μM 时，L02 细胞的存活率高于 70%）。此外，先前的研究表明，UDCA 通过保护肝星状细胞（HSCs）防止胶原蛋白的产生，并通过抑制自噬作用抑制细胞活力，具有抗纤维化的作用。因此，通过酯连接将近红外荧光团 HC-Cl-OH 与高频药物 UDCA 共轭，我们开发出了酯酶活化疗法荧光原药（HC-Cl-UDCA）。经酯酶激活后，HC-Cl-UDCA 中的酯键被裂解，释放出 HC-Cl-OH 和 UDCA。这产生了荧光信号的变化，促进了 UDCA 的有效传递，实现了近红外荧光介导的精确诊断和治疗。所有化学结构都通过核磁共振和质谱进行了全面表征。
HC-Cl-UDCA 在酯酶作用下的光学特性
在 PBS 缓冲液（10 mM，pH 7.4）中，通过紫外可见光谱和荧光光谱评估了 HC-Cl-UDCA 的光学特性及其对酯酶的反应性。与酯酶反应后，HC-Cl-UDCA 的最大吸收峰红移至 690 nm，并伴随着明显的颜色变化（从蓝紫色变为青绿色）。同时，725 nm波长处的荧光强度增加了 37 倍。响应速度是评价荧光探针性能的一个关键参数。因此，测定了酯酶存在下 HC-Cl-UDCA 在 725 纳米波长处的荧光动力学。加入酯酶后，HC-Cl-UDCA 的荧光强度迅速增加，在 100 秒内达到峰值。为了进一步研究 HC-Cl-UDCA 与酯酶之间的相互作用，进行了滴定实验。随着酯酶的加入，HC-Cl-UDCA 在 725 nm 波长处的荧光强度逐渐增加，在 0-5 U/mL范围内呈良好的线性关系。计算得出 HC-Cl-UDCA 的检测限（LOD，3σ/k）为 0.04 U/mL。接下来评估了 HC-Cl-UDCA 对各种分析物的选择性。直方图显示，只有在与酯酶反应时，HC-Cl-UDCA 的荧光强度才会显著增加。稳定性实验表明，HC-Cl-UDCA 及其与酯酶反应产物的荧光稳定性极佳。此外，为了证实酯酶的催化水解作用，还使用丝氨酸水解酶抑制剂 4-（2-氨基乙基）苯磺酰氟盐酸盐（AEBSF）进行了抑制剂实验。且随着 AEBSF 浓度的增加，荧光强度急剧下降，这表明 HC-Cl-UDCA 的荧光变化确实是由酯酶催化水解引起的。综合来看，这些实验结果表明 HC-Cl-UDCA 对酯酶表现出高灵敏度、高选择性以及优异的光稳定性，使其适用于在复杂生理条件下监测酯酶活性。
酯酶激活后释放 HC-Cl-OH 和 UDCA
根据我们的设计，HC-Cl-UDCA 与酯酶反应后会释放出近红外荧光团 HC-Cl-OH 和 UDCA。HC-Cl-UDCA 对酯酶的光学响应实验表明，荧光发生了显著变化，证实了高频诊断的可行性。对于高频治疗，药物 UDCA 的释放至关重要。因此，用 HR-MS 分析了 HC-Cl-UDCA 与酯酶的反应产物。结果表明，与酯酶反应后存在 HC-Cl-OH（HR-MS：418.15771）和 UDCA（HR-MS（M + H）：393.21017）。这些实验结果证实了酯酶活化 HC-Cl-UDCA 后生成了 HC-Cl-OH 和 UDCA，为 HC-Cl-UDCA 在高频诊断和治疗中的应用奠定了基础。
检测活细胞中的酯酶
受到 HC-Cl-UDCA 对酯酶的出色荧光响应的鼓舞，我们进一步将 HC-Cl-UDCA 用于检测活细胞中的内源性酯酶。检测内源性酯酶的方法是使用酯酶过表达的人类肝癌细胞（HepG2 细胞），而来自正常人类肝细胞的低酯酶表达的 L02 细胞则作为对照。在成像实验之前，使用 CCK-8（细胞计数试剂盒-8）测定法评估了 HC-Cl-UDCA 在 HepG2 和 L02 细胞中的细胞毒性。用 0-15 μM HC-Cl-UDCA 培养 HepG2 和 L02 细胞 24 小时后，细胞存活率仍保持在 70% 以上，表明 HC-Cl-UDCA 的细胞毒性较低。随后，用 10 μM HC-Cl-UDCA 培养 HepG2 和 L02 细胞 15 分钟。然后以 633 nm 为激发波长，从红色通道（700-750 nm）收集荧光信号。HepG2 细胞在与 HC-Cl-UDCA 培养后显示出明亮的红色通道荧光，而 L02 细胞几乎没有荧光。为了进一步研究 HC-Cl-UDCA 的成像特性，在 HepG2 细胞中进行了抑制实验。用 0.5 或 1 mM AEBSF 预培养 HepG2 细胞 30 分钟，然后用 HC-Cl-UDCA 培养 15 分钟。AEBSF 处理后，HepG2 细胞的红色通道荧光消失。这些结果具有统计学意义（p < 0.01），证实荧光强度确实是 HC-Cl-UDCA 与酯酶反应的结果。此外，酯酶的关键作用通过流式细胞术实验得到了验证。与L02细胞（1.85%）相比，HepG2细胞表现出显著更高的荧光强度（56.04%），在与0.5或1 mM AEBSF孵育后显著下降（分别为16.76%和10.64%）。
HC-Cl-UDCA 在体内的生物分布
HC-Cl-UDCA 在体内的生物分布是其应用于肝脏疾病的关键因素。以往的研究表明，胆酸（CA）可增强荧光探针的肝内靶向能力，显著增加其在肝脏中的蓄积。作为一种次级胆汁酸，UDCA 与 CA 具有高度相似的化学结构。因此，我们假设 UDCA 可以提高 HC-Cl-UDCA 的肝内靶向能力。作为对照，我们合成了一种基于苯甲酸酯的传统酯酶探针（HC-Cl-BC）。通过苏木精和伊红（H&E）染色评估了 HC-CI-BC 的生物相容性。注射后 24 小时的组织病理学检查显示，主要器官没有明显的损伤，包括充血、出血或坏死，表明其具有很高的生物相容性。静脉注射 HC-Cl-UDCA 或 HC-Cl-BC 后，连续采集小鼠的背部和腹部图像。注射 HC-Cl-UDCA 或 HC-Cl-BC 5 分钟后，只在肝脏中观察到明显的荧光，表明这两种探针主要在肝脏中蓄积。然而，肝脏中 HC-Cl-BC 的荧光强度明显高于 HC-Cl-UDCA。我们推测这可能是由于 HC-Cl-BC 对硫醇的非特异性反应。为了验证这一点，我们评估了 HC-Cl-BC 对硫醇的反应。这些结果显示，加入GSH或Cys 6分钟后，HC-Cl-BC的荧光强度显著增加（分别增加了17.675倍和11.875倍），而HC-Cl-UDCA则没有这种反应。这表明，HC-Cl-BC在肝脏中高荧光强度是由于其与GSH或Cys的非特异性相互作用，而并非比HC-Cl-UDCA具有更高的肝脏积累。此外，我们观察到注射25分钟后，HC-Cl-BC被代谢进入肠道（黄色箭头），而肝脏的荧光信号在45分钟时完全消失。相比之下，即使在注射45分钟后，HC-Cl-UDCA的肝脏荧光信号仍然存在。这表明，HC-Cl-UDCA在肝脏的滞留时间比HC-Cl-BC更长。通过二次注射实验，我们进一步确认了HC-Cl-UDCA的肝脏滞留能力。体外荧光成像显示，二次注射后，HC-Cl-UDCA的肝脏荧光强度明显高于HC-Cl-BC。这些结果支持了HC-Cl-UDCA作为肝脏疾病治疗荧光前药的潜在应用。
高血压的活体诊断和治疗
HC-Cl-UDCA 在酯酶反应和肝脏保留方面的优异表现令我们深受鼓舞，因此我们探索了其在高血压诊断和治疗中的应用。HC-Cl-UDCA 用于高血脂诊断和治疗评估的示意图。按照之前报道的方法，通过向 ICR 小鼠（6 周大）腹腔注射含有 20% CCl4 的油溶液（CCl4:橄榄油 = 1:4，每三天注射一次），建立了高血脂小鼠模型。同时，单独注射橄榄油的小鼠作为对照组。
为诊断高房颤动，ICR小鼠被随机分为两组：对照组和高房颤动组。在 CCl4 诱导 0、1、2、3 和 4 周后，静脉注射 HC-Cl-UDCA，对小鼠腹腔进行时间依赖性成像。注射后 5 分钟，各组小鼠肝脏区域的荧光最强，表明 HC-Cl-UDCA 在肝脏中迅速蓄积。因此，5 分钟时的荧光强度被选为高频的诊断指标。值得注意的是，在 CCl4 诱导一周后，HF 组肝脏区域的荧光强度明显高于对照组，这表明在 CCl4 诱导 HF 的早期阶段，肝脏酯酶水平有所增加。此外，诱导 2、3 和 4 周后，肝脏荧光强度略有下降，但仍高于对照组。H&E 染色显示，CCl4 诱导一周后，肝脏组织发生了明显的组织病理学改变（黑色箭头）。在中央静脉周围观察到广泛的肝细胞坏死，并伴有核溶现象；红色箭头：局灶性淋巴细胞浸润；蓝色箭头：大量出血；绿色箭头：肝细胞明显水肿性变，特征为细胞肿胀、染色淡、胞质松散排列。因此，使用HC-Cl-UDCA后，我们在CCl4诱导后一周即可检测到肝损伤。离体成像显示，经过4周诱导后，小鼠肝脏呈深黄色且起皱。此外，血清谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST）及白蛋白（ALB）水平均显著升高（ALT: 328.006 U/L，AST: 411.374 U/L，ALB: 40.058 g/L），提示肝细胞受损严重。这些结果确认了肝损伤的存在，并进一步验证了荧光成像在肝纤维化诊断中的可靠性。因此，肝脏酯酶水平可作为一种用于早期肝纤维化诊断的创新生物标志物，为及时治疗干预提供可能。
利用 HC-Cl-UDCA 实现了对高血脂的早期诊断，因此我们进一步探索了其治疗高血脂的潜力。我们将 ICR 小鼠随机分为四组：对照组、HF 组、Met（二甲双胍，一种保肝药物）治疗组和 HC-Cl-UDCA 治疗组。除治疗干预外，其他条件保持一致。治疗组在 CCl4 诱导 2 周后开始接受治疗。Met 治疗组每天饮用含有二甲双胍（1 g/L）的纯净水，而 HC-Cl-UDCA 治疗组每两天静脉注射一次 HC-Cl-UDCA（150 μM，150 μL）。给药 1 周和 2 周后，通过静脉注射 HC-Cl-UDCA 对小鼠腹腔进行时间依赖性成像。使用 HC-Cl-UDCA 治疗仅一周后，小鼠肝脏荧光强度显著下降，表明治疗小鼠的肝酯酶水平恢复正常，CCl4 引起的高血脂可能得到缓解。体内外图像显示，接受 HC-Cl-UDCA 治疗的小鼠肝脏呈玫瑰色且光滑，形态与对照组和 Met 治疗组相似。此外，血清中的谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST）和谷草转氨酶（ALB）水平下降至与对照组和 Met 治疗组相当的水平。结合肝脏形态学和血清诊断结果，我们确认 HC-Cl-UDCA 通过体内释放熊去氧胆酸（UDCA）对心力衰竭（HF）具有显著的治疗效果。上述结果表明，酯酶可作为心力衰竭早期诊断的创新生物标志物，同时 HC-Cl-UDCA 可作为一种非侵入性的荧光前药，用于心力衰竭的早期诊断和有效治疗。
结论
总之，我们开发出了一种治疗荧光原药（HC-Cl-UDCA），可用于心房颤动的早期诊断和靶向治疗。HC-Cl-UDCA 可被酯酶快速激活（< 100 秒），并具有出色的肝脏保留能力。HC-Cl-UDCA 被高浓度酯酶激活后，可释放荧光信号进行诊断，并以精确控制的方式将 UDCA 输送到病变部位进行治疗。重要的是，我们利用 HC-Cl-UDCA 实现了对 CCl4 诱导的小鼠高频房颤的早期诊断和同步靶向治疗。这种单分子治疗原药可实现精确、可控的药物释放，从而将副作用降至最低，并可在治疗过程中实时评估疗效。我们的研究结果表明，HC-Cl-UDCA 可为解决早期高血压的诊断和治疗难题提供一种新策略，从而改善患者的预后。未来的研究将重点关注其临床前安全性以及在肝脏疾病中的更广泛应用。
参考文献
Esterase-activated fluorescent prodrug for targeted early diagnosis and treatment of hepatic fibrosis ,Jiahong Ai, Xingwei Li, Yurong Zhang, Fangjun Huo* & CAixia Yin*. Sci China Chem, 2025, 68, https://doi.org/10.1007/s11426-025-2731-6
