内容提要
我们开发了CC-NO探针，其使用邻苯二胺进行NO检测，并使用近红外（NIR）色烯鎓-花青杂化物作为荧光团。CC-NO提供优异的NO检测、高选择性和在720 nm处125倍的荧光增长，检测限为0.201 µM。它可以监测RAW 264.7细胞中的NO水平，并在LPS和λ-角叉菜胶诱导的RA小鼠模型中进行体内近红外成像。
有毒的氧源性自由基，如一氧化氮（NO），在RA局部过量产生。NO的持续存在诱导软骨细胞凋亡，损伤软骨，激活破骨细胞，并募集免疫细胞，恶化炎症。活化的巨噬细胞是NO的主要来源，并且它们引发的NO水平升高导致关节破坏和功能丧失。因此，NO水平的持续增加不仅引发RA中的炎症，而且在关节损伤中起核心作用，这突出了NO检测对早期RA诊断的重要性。荧光探针具有高度的灵敏度和选择性，可通过非侵入性、实时的体内监测来精确识别目标分析物。这些特性推动了它们的普及，使其成为快速发展的研究领域。在650-900 nm范围内的NIR荧光探针对于体内应用特别有利，提供了最小的背景干扰，减少了光损伤，并增强组织渗透。最近在基于小有机分子的NO荧光探针的开发方面取得了进展。这些探针通常通过“关-开”机制操作，其中在与NO反应之前发射较弱，随后在相互作用时强度显著增加。虽然对细胞和体内成像有效，但这些探针由于重叠的吸收和发射波长而面临吸收串扰的问题，限制了检测灵敏度。此外，许多人缺乏线粒体靶向基团，阻碍了线粒体内NO的准确测量，因此，我们需要研发具有大Stokes位移和增强开启响应特性的线粒体靶向一氧化氮探针，以实现对线粒体一氧化氮水平的精确评估。本研究介绍了一种新型的NO激活的近红外探针，CC-NO，用于RA中灵敏的NO检测。基于近红外荧光色烯鎓-花青杂化物（CC-Fluor），使用邻苯二胺作为反应位点，它具有优异的NO识别性能，表现为：（1）高选择性;（2）高灵敏度（检测限为0.201 µM）;（3）显著的斯托克斯位移（80 nm）和较强的近红外荧光（125倍增强）。该探针具有低细胞毒性，能够实时检测活细胞中的外源性和内源性NO。应用于LPS/λ-卡拉胶诱导的RA小鼠模型，该探针还评估了PTP的抗关节炎作用，减少中性粒细胞浸润和促炎细胞因子的产生。通过激活AMPK/Nrf 2通路，PTP降低LPS刺激的RAW264.7细胞中的iNOS和TNF-α水平，支持PTP作为潜在的RA治疗剂。总体而言，CC-NO是一种灵敏可靠的近红外监测NO相关项目的探针。
CC-NO响应NO研究
为了评估探针CC-NO响应NO的有效性，我们对其光学性质进行了全面的分析。CC-NO在可见光区表现出最小的吸收，并且在其闭环形式中没有表现出可检测的荧光发射。在测试条件下，游离的CC-NO溶液是无色且无荧光的（Φ < 0.005）。该特征提供了低背景光信号，加入NO后CC-NO溶液在680 nm附近有明显的吸收峰，在720 nm处有较强的荧光发射。CC-NO的螺环结构在与NO反应时发生开环反应，CC-Fluor是一种具有多种理想性质的近红外荧光团，包括具有高量子产率（在甲醇中Φ = 0.42）的强近红外荧光、中等Stokes位移（约80 nm）和优异的光稳定性。随着向 CC-NO 中加入更高浓度的一氧化氮 (NO)，溶液的荧光强度逐渐增强。此外，720 nm处的荧光强度随NO浓度线性增加（R² = 0.9994），对应于约0.201 μM（3σ/k）的低检测限。CC-NO及其与NO的反应产物的荧光强度在pH 5-10范围内保持一致，表明CC-NO非常适合在生理pH条件下使用。在另外的实验中，单独的CC-NO没有显示出任何荧光发射；然而，当它与NO反应时，检测到荧光的显著增强。采用时间依赖荧光光谱法检测暴露于NO时CC-NO荧光的动力学。对于CC-NO，在大约20分钟的时间内获得了200 µM NO的稳定荧光读数。这些发现表明CC-NO能够在生物系统内实时检测NO。
活细胞中NO的成像
为了评估CC-NO的实用性，我们探索了活细胞中的NO成像。通过共定位实验进一步研究了CC-NO在细胞内的分布。在存在外源性NO的情况下，用CC-NO孵育的RAW 264.7细胞显示红色荧光。荧光与Mito-Tracker绿色共定位良好，产生0.88的皮尔逊系数。相反，CC-NO显示与其他细胞器标记物的较低共定位，如内质网和溶酶体，皮尔逊系数分别为0.68和0.70。这些结果表明，CC-NO具有良好的膜通透性和在线粒体优先积累。向细胞中引入不同浓度的NO（0、50、100和150 μM），然后加入CC-NO。在对照组中，CC-NO的荧光几乎是可辨别的，而加入不同浓度的NO后，细胞的荧光明显增强。这些观察结果表明，CC-NO对检测活细胞内的外源性NO表现出高灵敏度。当细胞与探针CC-NO单独孵育时，几乎检测不到红色荧光。然而，用50 µM、100 µM和200 µM浓度的S-亚硝基-N-乙酰青霉胺（SNAP，一种已知的NO供体）预处理1小时，然后用CC-NO孵育1小时，导致红色荧光强度随着NO浓度的升高而显著增加。这些结果表明CC-NO具有良好的细胞膜通透性，可以有效地成像活细胞中的外源性NO。基于CC-NO在活细胞中检测外源性NO的能力，我们评估了其在检测内源性NO中的功效。LPS（一种有效的炎性内毒素）诱导NO合酶表达和随后的NO产生。结果表明，细胞荧光强度随LPS暴露时间延长而增强。为了确认荧光增强是由于内源性NO，我们测试了NO合酶抑制剂L-NMMA。加入L-NMMA后，LPS刺激的细胞荧光减弱，说明CC-NO可以显示内源性NO。
RA小鼠模型中NO的体内成像
连续注射LPS或λ-卡拉胶可以建立RA小鼠模型，结果显示了RA小鼠模型的建立和CC-NO荧光成像。在建立RA模型后，将CC-NO探针注射到LPS诱导和λ-卡拉胶诱导的RA小鼠的足部。体内成像显示，注射CC-NO后15分钟内荧光迅速显著增加，并在30至60分钟内保持稳定。这些结果表明，CC-NO探针与RA中的NO快速反应，在15分钟内，LPS诱导的RA的F/F0比值达到28.1，λ-卡拉胶诱导的RA的F/F0比值达到25.7。当用甲氨蝶呤（MTX）（一种常见的关节炎药物）预处理LPS或λ-卡拉胶诱导的RA小鼠的足部时，荧光强度显著降低，接近正常关节水平，表明MTX对RA的治疗效果。在随后的实验中，PTP被给予LPS诱导的和λ-卡拉胶诱导的RA小鼠，并且使用CC-NO监测炎症期间的NO水平。在RA小鼠模型中用PTP预处理导致足中的荧光信号减弱，恢复到正常水平，表明PTP减轻了RA中的炎症。为了提高本研究对未来临床应用的相关性，我们分析了CC-NO的体内稳定性、药代动力学特性和清除途径。经过结构优化，CC-NO在生理条件下保持良好的化学稳定性。其螺环结构在与NO反应前有效抑制背景荧光，提高信号特异性，减少非特异性干扰。荧光产物CC-Fluor已被证明具有优异的光稳定性和生物相容性，使其适用于生物环境。鉴于其中等的分子量和疏水性，CC-NO可能主要通过肝脏代谢清除，这种方式常见于许多小分子荧光探针。此外，考虑到CC-Fluor衍生物优异的近红外荧光特性，未来的研究应探索其用于多光子激发（例如，800-810 nm）或基于上转换成像的潜力，以实现更深的组织穿透并增强其在体内和临床成像中的适用性。
结论
我们开发了一种新型的近红外荧光探针CC-NO，用于灵敏地检测RA中的NO。CC-NO具有优异的性能，包括高选择性、灵敏度（检测限为0.201 μM）、显著的近红外荧光增强（在720 nm处>125倍）和最小的细胞毒性。该探针能够实时监测活细胞中外源性和内源性NO水平，并能够在LPS/ λ-卡拉胶诱导的RA小鼠模型中对NO产生进行体内近红外成像。此外，CC-NO用于评价PTP的抗关节炎作用，显示PTP通过减少中性粒细胞浸润和促炎细胞因子产生而显著减轻RA症状。
参考文献
Inflammation-responsive near-infrared fluorescence probe for real-time imaging of NO and its antiarthritis evaluation of protopine ,Peipei Wang Da, Hailin Zhang , Long, wei He* , Renpu Cao , Songjiao Li , Sensors and Actuators: B. Chemical 445 (2025) 1385566,https://doi.org/10.1016/j.snb.2025.138556
