内容提要
本文报道了两种新的具有D−π−A共轭结构的黄杂环烯类化合物JB-1和JB-2。JB-1和JB-2各自具有分别连接到四苯乙烯或三苯胺共轭骨架上的供电子和接受电子基团。由于分子内转动的限制，JB-1的吸收波长大于638 nm，在750 nm的第一近红外窗口处有较强的发射，与ICG相比红移了117 nm。相反，JB-2在第二近红外区显示出971 nm的发射峰，吸收超过691 nm。JB-2还具有1204 nm的荧光肩峰，为体内生物成像提供了卓越的分辨率。此外，JB-2在体外和体内的癌症治疗中都显示出良好的光热和光动力学效应。
JB-1和JB-2的设计和光物理性质
将(5-甲酰亚硫基[2，3-b]硫代-2-基)硼酸与2，4-溴-N，N‘-二(4-甲氧基苯基)苯胺偶联，分别生成中间体3和4。最后，通过3和4与化合物1的典型亲核取代反应合成了JB-1和JB-2。为了评估JB-1和JB-2的光物理性质，我们首先用UV−Vis吸收光谱和荧光光谱研究了它们的吸收和发射光谱。JB-1在DMSO中的吸收和发射波长分别为633 nm和750 nm，斯托克斯位移为117 nm。相比之下，JB-2在DMSO中的吸收波长为691 nm，发射波长为971 nm(NIR-II)。吸收和发射波长的红移可以归因于TRIP-TPA基团的强给电子效应。与JB-1相比，JB2表现出更大的斯托克斯位移280 nm。
为了比较它们的光热效应，我们用808 nm激光照射了PBS中的JB1和JB-2(50μM)。将溶液暴露在0.5、1.0、1.5和2.0W/cm2的激光功率下10分钟。在不同功率水平下，用808 nm激光照射JB-1没有产生明显的加热效应，在2.0W/cm2条件下，最高温度记录为33.8°C。相比之下，JB-2表现出明显的光热响应，在相同的照射条件下达到62.8°C。然后，将JB-1和JB-2溶解在不同浓度(25，50，75，100和200μM)的PBS溶液中。每个溶液都被808 nm激光(1.0W/cm~2)照射到600S。JB-1只有轻微的温度上升，在25μM时达到28.2°C，在200μM时达到最大36°C。相比之下，JB-2表现出明显的浓度依赖性光热效应，随着浓度的增加，温度稳定在43.5°C、49.6°C、56°C、58°C和65.3°C，显示出比JB-1更高的光热转换效率。根据计算，JB-2的光热转换效率约为38.71%。
我们使用荧光指示剂2‘，7’二氯二氢荧光素(DCFH)来检测JB-1和JB-2的ROS产生能力。在黑暗条件下，将JB-1和JB-2分别与DCFH指示剂混合，用808 nm激光(1.0W/cm2)照射300S，然后用荧光光谱仪测量荧光强度的变化。JB-1/DCFH和JB-2/DCFH溶液的荧光强度随着激光照射时间的延长而逐渐增强，证实了JB-1和JB-2都能够在激光照射下产生ROS。为了进一步鉴定产生的特定类型的ROS，我们使用了一系列荧光探针：DHR123用于超氧阴离子(O2·−)，ABDA用于单线态氧(1O2)，羟基苯基荧光素(HPF)用于羟基自由基(·OH)。在黑暗条件下，JB-1和JB-2分别与各自的ROS指示剂混合，用808 nm激光(1.0W/cm2)照射300S(高能脉冲60S)。荧光强度和吸光度变化分别用荧光分光光度计和紫外分光光度计监测。JB-1/DHR123和JB-2/DHR123溶液的荧光强度随着激光照射时间的延长而逐渐增强，表明O2·−的产生。同时，在JB-1/ABDA和JB-2/ABDA溶液中观察到吸光度略有下降，这表明在相同的持续时间内产生的单线态氧是适度的。此外，HPF荧光分析表明，JB1的荧光强度明显强于JB-2，表明JB-1具有较强的产生·OH的能力。为了进一步证实ROS的产生，用5-叔丁氧基-5-甲基−1-吡咯啉N-氧化物作为自由基自旋捕捉剂进行了电子顺磁共振实验。照射后，JB-1和JB-2都显示出特征的ROS信号。值得注意的是，JB-1产生了更强的·OH信号，而JB-2产生了·OH和O2·−的组合。
JB-1和JB-2的细胞成像和光疗效率
为了直接观察JB-2对PTT和PDT的协同作用，进行了细胞光热成像实验。JB-1处理的细胞在照射下表现出温和的温度上升，达到31.4°C，而JB-2处理的细胞显示出显著的上升，达到57.9°C，证实了其优越的光热响应。以DCFH-DA为指示剂的互补细胞ROS成像实验。JB-1和JB-2在黑暗条件下都表现出微弱的荧光强度，表明ROS的产生很少。然而，在808 nm激光照射下，两者的荧光强度都显著增加，证实了有效的ROS产生。半定量分析表明，在相同的照射下，JB-2产生的ROS大约是JB-1的1.3倍。这些发现进一步得到了细胞ROS分类分析的支持，证实了JB-1和JB-2在激光照射下都能够产生大量的O2·−、1O2和·OH。尽管基于溶液的检测表明JB-1的内在光动力活性更强，但JB-2的光热性能增强导致了细胞环境中更强的PTT/PDT协同效应，导致在相同的照射条件下有更大的细胞毒性。我们进一步用钙黄素AM和碘化丙啶(PI)染料对4T1细胞进行染色，以区分PDT/PTT过程中的活细胞和死亡细胞。JB-2或单独照射的细胞显示钙调素AM的绿色信号明显，PI的红色荧光可忽略不计，这表明JB-2在黑暗中的细胞毒性最小。而808 nm照射5min后，与JB-2共孵育的4T1细胞可检测到明显的红色荧光，证实JB2可被激光有效激活，并通过PDT/PTT协同机制诱导肿瘤细胞死亡。
将4T1和MCF-10A细胞置于不同浓度的JB-1和JB-2(1、5、10和20μM)中孵育0.5h，在徕卡共聚焦显微镜(JB-1：λex=638 nm，λem=700−780 nm)和奥林巴斯共聚焦显微镜(JB-2：λex=640 nm，λem=800−900 nm)下进行荧光成像。JB-1和JB-2都被正常和肿瘤细胞内化，呈现红色荧光，并以浓度依赖的方式增强。这些发现突出了JB-1和JB-2出色的活细胞成像能力。此外，利用激光共聚焦扫描显微镜(CLSM)在4T1癌细胞中进行了共定位分析，以确定JB-1和JB-2的亚细胞定位。商业化的细胞器特异性染料Mito Green、ER-Green和Lyso Green分别用于标记线粒体、内质网和溶酶体。JB-1和JB-2主要积累在溶酶体中，与LysoRed的皮尔森相关系数分别为0.83和0.72。JB-1与线粒体和内质网的共定位系数分别为0.48和0.50，JB-2与线粒体和内质网的共定位系数分别为0.35和0.57。这些发现表明，JB-1和JB-2可以作为有效的溶酶体靶向荧光探针用于近红外成像应用。
JB-2的肿瘤治疗与代谢途径
鉴于近红外荧光因其长波长发射而具有出色的组织穿透能力，我们首先评估了JB-2的荧光穿透深度。JB-2的穿透深度可达8毫米，在4毫米的深度观察到清晰可辨的成像。 由于其NIR-II荧光成像特性，JB-2不仅精确标记了肿瘤的位置和边界，还为PDT/PTT提供实时指导，以提高治疗效率的同时最大限度地减少对周围健康组织的损害。在瘤内注射200μL JB-2（200μM）后，进行动态肿瘤荧光监测。强荧光即使在96 h后仍在肿瘤中持续存在，表明其具有长期体内荧光监测的优势。为了研究JB-2的代谢途径，我们将100μL的JB-2(100μM)注入裸鼠尾静脉，并在NIR-II窗口(λex：808 nm；滤光片：LP 880；功率：2W/cm2；暴露时间：300ms)监测其在体内的荧光代谢过程。JB-2在体内表现出极好的NIR-II荧光成像能力，主要聚集在肝脏和脾中。随着时间的推移，JB-2通过肝脏-胆汁排泄途径逐渐从体内清除。
光热成像对肿瘤内的温度变化高度敏感，能够实时评估PTT的治疗效果。瘤内注射后30min，用808 nm激光(1W/cm2)照射肿瘤部位，用红外热像仪监测肿瘤温度。在300S范围内，PBS组的体温仅升高了5.0°C，而JB-2+激光组的肿瘤温度显著升高了约28°C，10分钟后稳定在52℃左右。这些结果表明，JB-2在光照下表现出良好的光热转换效率和较强的PTT能力。我们进一步评价了JB-2对4T1荷瘤小鼠的PDT/PTT协同作用。在治疗的最初8天，PBS组、PBS+激光组和JB-2组的肿瘤生长没有明显的抑制作用。此外，在第8天和第16天之间，这三组患者的肿瘤生长明显加快。而JB2+激光照射组肿瘤生长相对较慢，说明光照下JB-2有效地抑制了肿瘤生长。肿瘤大小和重量分析进一步证实，JB2+激光治疗组显示出明显的肿瘤抑制。
结论
我们成功地开发了两种新型光疗剂JB-1和JB-2，其中JB-2使近红外II荧光成像引导的PDT和PTT成为可能。细胞实验证实了JB-2的有效摄取及其在溶酶体中的优先定位。比较评估进一步表明，JB-2的PDT和PTT的协同效应有效地诱导了细胞死亡，主要是通过线粒体破坏。JB-2通过近红外光激活和延长保留时间，对深埋肿瘤显示出更好的治疗效果。体内研究证实，JB-2通过PDT/PTT途径有效地诱导了caspase介导的细胞死亡，提高了治疗效果。
参考文献
Near Infrared-Responsive Xanthene Probes fo rDual-Mode Cancer Treatment and Bioimaging JunfengZhang, Lingyu Jin, Bin Xiao, Dongeun Kim, Siwei Hua, Yangmei Hua,Yangjie Liu, Xuefei Huang, Junfeng Kou,* Bo Liu, Xianghua Wu,Xiaolin Zhong, Amit Sharma,* Yuda Zhu,* WenXiu Ren,* JongSeung Kim* Anal.Chem., 2025,97,19597−19605. https://doi.org/10.1021/acs.analchem.5c02888.
