内容提要
我们报道了一种可激活的近红外荧光（NIRF）/ 光声（PA）大分子报告探针（BhCyNK），用于 TANKs 的实时成像。为优化 PA 性能，我们筛选了 BhCyNK 的荧光团骨架。在四种半菁衍生物中，具有最长最大吸收峰（~800 nm）、最高光热转换效率（71.13%）和 PA 亮度的 BhCyS 被构建到 BhCyNK 中，其在 TANK 过表达的蛋白酶存在下可特异性触发 NIRF 信号（增加 10 倍）和 PA 信号（增加 8.3 倍）。BhCyNK 可有效区分自然杀伤细胞与其他免疫细胞，包括 T 细胞、中性粒细胞和巨噬细胞。BhCyNK 的高特异性使其能够在癌症免疫治疗过程中实时监测活鼠肿瘤中的 TANKs 数量。成像结果显示，联合免疫治疗后 BhCyNK 的肿瘤内信号增加与 TANKs 数量增加密切相关。
设计、合成与表征
为开发具有增强型近红外荧光/光声双模态成像能力的荧光团，我们利用分子工程策略合成了一系列半菁骨架（BhCyS、BhCyO、hCyS、hCyO），具体方法包括替换受体单元并在原始半菁染料（hCyO）中引入硫原子。与 hCyO 相比，引入硫原子或替换受体均导致其吸收显著红移。其中，受体替换（BhCyO，760 nm）引起的红移（30 nm）比引入硫原子（hCyS，730 nm）更大。在荧光发射方面，受体替换导致荧光红移 60 nm 且荧光量子产率（Φ_F）降低 97.8%，而硫原子引入则引起 53 nm 的荧光红移和 74.9% 的 Φ_F 降低。在所有衍生物中，同时进行受体替换和硫原子引入的 BhCyS 具有最长的最大吸收峰（800 nm）和最大发射峰（825 nm），且 Φ_F 降低了 98.7%。
考虑到其水溶性较差，将它们与聚乙二醇（PEG）链共轭以改善水溶性。与 hCyO-PEG 相比，仅引入硫原子的 hCyS-PEG 在 680 nm 处的光声强度增强了 3 倍，波长略长。受体替换（BhCyO-PEG）使光声最大波长显著红移至 750 nm，信号强度较 hCyO-PEG 增强 6.2 倍。在四种荧光团中，BhCyS-PEG 表现出最长的光声最大波长和最高的光声信号，其在 780 nm 处的光声峰强度较 hCyO 增强 9.3 倍。为研究 BhCyS-PEG 的高光声强度，测量了四种荧光团的光热性能。在 808 nm 激光照射下，BhCyS-PEG 的最高温度达到 48.0°C，显著高于 hCyO-PEG（22.5°C）、hCyS-PEG（26.0°C）和 BhCyO-PEG（43.0°C）。计算得出 BhCyS-PEG 的光热转换效率（PCE）为 71.13%，是 hCyO-PEG 的 2.29 倍。将 BhCyS-PEG 和 BhCyO-PEG 的光热特性与吲哚菁绿（ICG）进行比较，在 808 nm 激光连续照射下进行五个加热 - 冷却循环后，BhCyS-PEG 和 BhCyO-PEG 的最高温度分别达到 48.5°C 和 43.1°C，而 ICG 仅为 38.0°C。此外，BhCyS-PEG 和 BhCyO-PEG 在五个循环中表现出高稳定性，而 ICG 在第一个循环后 PCE 显著下降。BhCyS-PEG 和 BhCyO-PEG 的高光稳定性归因于其高效的非辐射热衰减，抑制了单线态到三线态的系间窜越，从而减少了活性氧（ROS）的生成并防止了 ROS 诱导的分子结构损伤导致的自毁。进一步实验表明，在 808 nm 激光照射下，BhCyS-PEG 和 BhCyO-PEG 产生的单线态氧（¹O₂）、超氧阴离子（O₂⁻）和羟基自由基（・OH）可忽略不计。因此，BhCyS 具有适合 808 nm 光照射的最长吸收最大值和最高的 PCE，是四种半菁染料中的最佳候选者，因此被选择用于构建 TANK 可激活的 NIRF/PA 探针。
体外检测
为研究 BhCyNKH 的体外响应性，我们分析了其在存在和不存在 hGzmA 时的光学性质。BhCyNKH 在 700 至 800 nm 之间有一个宽吸收峰，最大吸收波长为 775 nm，且由于分子内电荷转移（ICT）被供电子羟基与 GzmA 可切割部分的笼合作用所抑制，初始时无荧光。与 hGzmA 孵育后，吸收峰红移至 800 nm，对应于去笼化的 BhCyS。此外，与 hGzmA 孵育前相比，BhCyNKH 在 825 nm 处的荧光增强了 10 倍。值得注意的是，BhCyNKH 初始光声信号较弱，与 hGzmA 孵育后在 780 nm 处的光声信号增强了 8.3 倍，且光声增强与 hGzmA 浓度密切相关。
BhCyNK 检测 NK 细胞的能力在多种活鼠细胞中进行了评估，包括 4T1 肿瘤细胞、原代中性粒细胞、骨髓来源的巨噬细胞（BMDMs）、原代 CD4⁺和 CD8⁺ T 细胞。值得注意的是，孵育 24 小时后，BhCyNKM 对 4T1 细胞的细胞毒性极小。BhCyNKM 在 NK 细胞中的 NIRF 和 PA 信号分别比 4T1 细胞高 4.4 倍和 4.2 倍，比 CD8⁺ T 细胞高 1.5 倍和 1.6 倍。为进一步验证 NK 细胞中信号增强是由于 GzmA 表达升高，进行了定量逆转录聚合酶链反应（qRT-PCR）以量化这些原代免疫细胞中的 GzmA mRNA 相对水平。结果表明，NK 细胞在测试细胞中表达最高的 GzmA mRNA 水平，比 CD8⁺ T 细胞高 1.8 倍，与先前报道的 NK 细胞中 GzmA 蛋白表达升高一致。此外，用 GzmA 抑制剂（3,4 - 二氯异香豆素，20 μM，1 小时）预处理 NK 细胞后，BhCyNK 的 NIRF 和 PA 信号均显著降低至与 4T1 细胞相似的水平，进一步证实其 NIRF/PA 信号增强特异性归因于 GzmA 的丝氨酸蛋白酶活性。
荷瘤小鼠体内 TANKs 的检测
利用 4T1 荷瘤 BALB/c 小鼠模型，探究了 BhCyNK 在肿瘤免疫治疗过程中对 TANKs 进行体内实时成像的能力，该模型的特征是与抗肿瘤免疫反应相关的 NK 细胞浸润。组织学分析显示，静脉注射 BhCyNKM 后 7 天内，主要器官未出现明显损伤，证实了其优异的生物相容性。荷瘤小鼠每两天接受一次抗程序性死亡配体 1（aPD-L1）、奥沙利铂（Oxa）、两者联合（Oxa/aPD-L1）或生理盐水治疗，共三次剂量3。治疗后，静脉注射 BhCyNK，进行 48 小时的纵向 NIRF 和 PA 成像，并对肿瘤部位的信号强度进行量化。对于所有治疗组，肿瘤部位的 NIRF 和 PA 信号均逐渐增加，在注射后 8 小时达到峰值，随后逐渐下降。定量分析表明，Oxa/aPD-L1 组肿瘤区域的最大 NIRF 强度比生理盐水治疗组高 3.8 倍。类似地，PA 成像结果与 NIRF 观察一致，Oxa/aPD-L1 治疗组在注射后 8 小时的 PA 信号强度峰值比生理盐水治疗组高 4.1 倍。值得注意的是，PA 成像能够清晰显示探针信号在肿瘤内的分布，为实时监测肿瘤微环境中的 NK 细胞浸润提供了一种有前景的无创策略3。实验结束时，对小鼠实施安乐死，收集肿瘤和主要器官进行离体成像分析。Oxa/aPD-L1 治疗组的肿瘤组织表现出明显更强的 NIRF 和 PA 信号，经量化分别比生理盐水治疗组高 4.2 倍和 3.45 倍。为评估 BhCyNK 的信号激活是否与免疫治疗后 TANKs 的浸润水平相关，对不同治疗组的肿瘤组织进行了流式细胞术和免疫荧光染色。Oxa/aPD-L1 治疗组的 TANKs（NKp46⁺CD49b⁺）百分比比生理盐水治疗组高 2.45 倍4。这与 BhCyNKM 的肿瘤内 NIRF 和 PA 信号呈正相关。免疫荧光染色进一步显示，在 Oxa/aPD-L1 治疗组中，GzmA 染色的红色荧光信号与 NKp46 染色的绿色荧光信号良好共定位。这些数据证实了 BhCyNKM 对 TANKs 进行无创实时分析的能力，以及其被肿瘤内 GzmA 特异性激活的特性。
结论
我们开发了一种 GzmA 特异性可激活近红外荧光/光声大分子报告探针（BhCyNK），能够在癌症免疫治疗过程中对 TANKs 进行实时、无创追踪，并通过 NIRF/PA 双模态成像为治疗结果提供预测工具。通过筛选一系列基于半菁骨架的荧光团（通过受体替换和硫原子引入），优化了 BhCyNK 的 NIRF/PA 成像性能。其中，BhCyS 因其优异的特性被选中：最长吸收峰（~800 nm）、最高光热转换效率（71.13%），且与其他衍生物相比，PA 信号强度增加 5.9 倍。基于 BhCyS，通过将供电子羟基与 GzmA 可切割肽段笼合，开发了 BhCyNK，其在 GzmA 存在下可特异性激活 825 nm 处的 NIRF 信号（增加 > 10 倍）和 780 nm 处的 PA 信号（增加 8.3 倍）。这种高特异性使 BhCyNK 能够有效区分 NK 细胞与其他免疫细胞。在荷瘤小鼠中，BhCyNK 表现出强大的体内检测能力，其 NIRF/PA 信号与流式细胞术分析证实的 TANKs 数量密切相关。
参考文献
Activatable Fluorescence/Photoacoustic Macromolecular Probe for Imaging of Tumor-Associated Natural Killer Cells,Yanbin Feng , Yuxuan Hu , Jing Liu*, Xianghan Zhang, Yan Zhang*, Zhongliang Wang* , Kanyi Pu*,Angew. Chem. Int. Ed. 2025, e202507765,https://doi.org/10.1002/anie.202507765
