内容提要
β- 葡萄糖醛酸酶（GUS）是一种在多种炎症性疾病中过表达的酸性水解酶，使其成为很有前景的炎症生物标志物。目前用于 GUS 活性实时原位成像的工具受到背景干扰的阻碍，这降低了它们在动态生物环境中的有效性。我们开发了 Ox-GUS，这是一种 GUS 特异性荧光探针，具有独特的分子设计，其特征在于破坏的共轭结构。该设计为 Ox-GUS 提供了近零背景光学特性、显著增强的信噪比和高灵敏度的检测能力。该探针对 GUS 活性的响应显示出高达 400 倍的荧光增强，检测限低至 0.0035 U/mL。我们成功地利用 Ox-GUS 在类风湿性关节炎、自身免疫性肝炎和炎症性肠病的小鼠模型中实时可视化 GUS 活性，并有效监测治疗反应。
Ox-GUS 对 GUS 的光学响应
首先研究了 Ox-GUS 与 GUS 反应前后的紫外 - 可见（UV-vis）光谱和荧光光谱变化。在添加 GUS 之前，Ox-GUS 呈无色透明状态，紫外吸收和荧光强度极低，这表明 Ox-GUS 几乎不产生背景信号。当加入 GUS 后，溶液颜色由无色变为蓝色，同时在 650 nm 和 680 nm 处分别出现明显的紫外 - 可见吸收峰和荧光发射峰。随后优化了 Ox-GUS 的反应条件，结果显示荧光强度在 1 小时时达到峰值。
GUS 的双模式检测
Ox-GUS 在 GUS 的荧光和比色双模式定量检测中表现优异。当 GUS 浓度从 0 增加到 15 U/mL 时，650 nm 处的紫外 - 可见吸收峰和 680 nm 处的荧光发射峰显著增强。值得注意的是，Ox-GUS 具有近零光谱背景信号，荧光增强可达 400 倍，显著高于其他 GUS 探针，同时具有出色的信噪比。在 0 至 6 U/mL 的浓度范围内，两种检测模式的信号增强与 GUS 浓度之间均呈现良好的线性关系。比色法的检测限为 0.0049 U/mL，荧光法的检测限为 0.0035 U/mL。Ox-GUS 的双模式检测能力实现了对 GUS 的高灵敏度检测，通过比色和荧光信号的互补验证，提高了分析的可靠性和准确性。
光稳定性与选择性
为评估 Ox-GUS 的实际应用潜力，我们还测定了其光稳定性和选择性。在 635 nm 光下连续照射 1 小时后，反应体系和探针的荧光强度保持稳定，表明其具有良好的光稳定性。我们选取人体中的常见物质作为潜在干扰物，考察它们对探针的影响。探针与这些物质共孵育后，荧光强度几乎没有变化。这证实了 Ox-GUS 对 GUS 具有高度选择性，适用于复杂的生物环境。
活细胞中 GUS 活性的荧光成像
在进行活细胞荧光成像前，使用 CCK8 法对 Ox-GUS 在 HepG2 细胞中的细胞毒性进行了测试。结果显示，浓度在 10 至 100 μM 范围内的 Ox-GUS 对细胞活力的影响可忽略不计，表明其具有良好的生物相容性。随后将 Ox-GUS 应用于 HepG2 细胞的荧光成像，并确定了细胞与探针的最佳孵育时间。结果显示，荧光强度随时间逐渐增加，在 50 分钟时达到最大值，因此选择 50 分钟作为最佳孵育时间。由于 β- 葡萄糖醛酸酶位于细胞溶酶体中，通过溶酶体共定位实验研究了 Ox-GUS 的细胞内分布。Ox-GUS 的红色荧光与商用溶酶体染料（LysoTracker Green）的绿色荧光表现出强烈重叠，皮尔逊相关系数为 0.90。这些结果表明，Ox-GUS 主要定位于溶酶体，能够准确原位可视化细胞内的 GUS。
为了在细胞水平可视化炎症反应期间 GUS 活性的变化，建立了脂多糖（LPS）诱导的炎症模型。结果显示，LPS 处理细胞的荧光强度显著高于对照组（未处理细胞），表明炎症期间 GUS 表达升高。为了证实荧光强度的增加是由于内源性 GUS 水平升高所致，对 LPS 诱导的炎症细胞用 GUS 特异性抑制剂黄芩苷进行处理。黄芩苷的加入显著降低了细胞的红色荧光。这一发现证实了炎症细胞中 GUS 表达升高是导致荧光增强的原因。这些结果表明，Ox-GUS 能够在细胞水平准确检测 GUS 水平的变化。
类风湿关节炎小鼠模型中 GUS 活性的荧光成像
类风湿关节炎（RA）是一种以滑膜炎为特征的自身免疫性疾病，会导致关节软骨和骨的破坏。这一进程最终会引起关节畸形和功能丧失。传统成像技术如 X 射线、CT、MRI 和超声已被广泛用于检测 RA然而，这些技术主要关注骨骼和关节的结构变化，无法捕捉病理层面的动态分子变化。 这限制了它们阐明 RA 潜在病理过程的能力。尽管研究发现 RA 中 GUS 表达增加，但尚未开发出利用这一特征进行 RA 诊断和治疗监测的诊断工具。为解决这一局限性，我们利用 Ox-GUS 可视化 RA 进展期间的 GUS 表达变化。通过向小鼠右胫骨关节注射 λ- 角叉菜胶建立 RA 模型，随后给予 Ox-GUS。荧光成像显示，注射探针后，小鼠关节的荧光随时间逐渐增强。值得注意的是，RA 小鼠关节的荧光显著强于对照小鼠，表明 RA 进展期间 GUS 表达明显升高。此外，我们评估了使用临床常用药物甲氨蝶呤治疗 RA 期间的 GUS 表达。结果显示，治疗小鼠的关节荧光显著降低，表明甲氨蝶呤有效降低了炎症关节中的 GUS 表达。
结论
我们开发了 Ox-GUS，这是一种针对 β- 葡萄糖醛酸酶（GUS）的特异性荧光探针，具有优异的光学特性，包括近零背景荧光和吸收。这些特性赋予其高信噪比，使其能够通过荧光和比色法对 GUS 活性进行高灵敏度检测。Ox-GUS 可有效可视化细胞炎症过程中 GUS 的上调表达。体内荧光成像证实，该探针能够灵敏地检测炎症组织中的 GUS 活性变化，这在类风湿性关节炎、自身免疫性肝炎和炎症性肠病的小鼠模型中均得到验证。
参考文献
Low-background Near-infrared Fluorescent Probe for Real-time Monitoring of β0Glucuronidase Activity in Inflammation and Therapy,Dianfeng Dai, Zhimin Zhang, Mo Ma, Chen Zhao, Jingkang Li, Siqi Zhang, Pinyi Ma,* Qiong Wu,* and Daqian Song,Anal. Chem. 2025, 97, 9414−9421,https://doi.org/10.1021/acs.analchem.5c00658
