内容提要
我们通过在喹啉- 呫吨近红外骨架中引入 N,N - 二甲基氨基甲酰作为 AChE 传感基团，合理设计了一种近红外（NIR）荧光探针（QXMC）。QXMC 对 AChE 表现出高灵敏度、优异的选择性和超快的响应时间（0.5 秒内）。此外，QXMC 能够灵敏监测凋亡或氧化应激过程中神经元细胞和斑马鱼体内 AChE 活性的波动。利用 QXMC 出色的血脑屏障（BBB）穿透能力，我们首次通过非侵入性近红外活体成像发现急性癫痫小鼠脑内 AChE 水平下调。此外，通过 QXMC 监测 AChE 还实现了癫痫治疗效果的可视化评估。
乙酰胆碱酯酶响应型 QXMC的合成以及光学响应
荧光探针 QXMC 的设计是通过将 N,N - 二甲基氨基甲酰基连接到喹啉。在 CH₃CN/PBS（1/49，v/v，pH 7.4）中研究了 QXMC 对 AChE 的光谱响应。QXMC 在 520 nm 处有吸收（ε = 2.57×10⁴ L・mol⁻¹・cm⁻¹），而 QXOH 则观察到红移至 570 nm 的吸收（ε₁ = 2.57×10⁴ L・mol⁻¹・cm⁻¹）。在 AChE 存在的情况下，QXMC 的荧光信号显著增强，这与 QXOH 的荧光信号高度吻合。考虑到绝对信号强度、低背景水平以及与荧光成像激光的兼容性，选择 633 nm 的长波长作为 AChE 活性检测的最佳激发波长。QXMC 在 678 nm 处表现出微弱的荧光。当 AChE 活性从 0 增加到 2.0 U/mL 时，观察到荧光强度逐渐增加，当 AChE 活性达到 2.0 U/mL 时，响应增强了 5.4 倍。这可归因于 AChE 的水解作用，从而释放出荧光性的 QXOH，如 Scheme 1 所提出的。I₆₇₈ nm 处的荧光强度与 AChE 活性在 0-2.0 U/mL 范围内表现出优异的线性关系（I₆₇₈ nm = 63169.72 [AChE]（U/mL）+35038.21，R²=0.9820），检测限低至 8.56 mU/mL（3σ/k），表明对 AChE 具有出色的灵敏度。有趣的是，QXMC 在诸如人血清等生物溶液中也表现出对 AChE 的良好反应，进一步证明了其对 AChE 响应的高灵敏度。
评估了 QXMC 在存在 2.0 U/mL AChE 时的时间依赖性动力学。令人惊讶的是，678 nm 处的荧光强度仅在 0.5 秒内就达到了最大值，这是已报道的 AChE 敏感探针中最快的响应时间。此外，QXMC 单独或在 AChE 存在下，在 633 nm 激发后均表现出良好的光稳定性。生物系统中活性物质的多样性可能会影响 QXMC 对 AChE 的响应，因此探针的选择性是体内分析的基石。因此，研究了 QXMC 在一些水解酶（2 U/mL 丁酰胆碱酯酶、10 U/mL 酯酶和 10 U/mL 胃蛋白酶）、抗坏血酸、葡萄糖、氨基酸（500 μM Cys、GSH、Hcy、His、Glu、Arg、Tyr、Leu、Asp）、阳离子（500 μM K⁺、Na⁺、Ba²⁺、Fe³⁺、Fe²⁺、Cu²⁺；NH₄⁺）、阴离子（500 μM CO₃²⁻、HCO₃⁻、HPO₄²⁻、S₂O₃²⁻）和活性氧（ROS，包括 100 μM H₂O₂、O₂⁻、・OH、ONOO⁻）存在下的荧光响应。令人鼓舞的是，只有 AChE 能引起显著的荧光增强，表明 QXMC 对 AChE 具有极好的选择性。此外，QXMC 在较宽的 pH（3.0-10.0）范围内稳定，并且在 pH 7.4 下与 AChE 反应后显示出明显的荧光增强，表明 QXMC 非常适合在生理条件下检测 AChE。综上所述，上述结果表明 QXMC 对 AChE 具有高灵敏度、优异的选择性和超快的响应时间，使其在复杂的生物环境中用于 AChE 的实时成像具有潜力。
对 AChE 具有出色的体外传感能力，QXMC 随后被用于活细胞成像。选择小鼠海马神经元细胞系（HT22）作为脑相关神经元细胞模型，以探索 QXMC 的细胞内成像潜力。在荧光成像之前，首先使用 MTT 法评估了 QXMC 对 HT22 细胞的毒性。当 QXMC 的浓度小于 10 μM 时，HT22 细胞的存活率高达 88%，表明在成像条件（5 μM）下，QXMC 对活细胞的细胞毒性可以忽略不计。我们进一步研究了 QXMC 在 HT22 细胞中对内源性 AChE 活性变化的响应能力。仅用 QXMC 染色的对照细胞在细胞质内发出可检测的荧光信号，这可能源于 HT22 细胞中的内源性 AChE。有趣的是，在用新斯的明（目前临床使用的有效 AChE 抑制剂）预处理的细胞中，这种荧光明显淬灭，表明 QXMC 对内源性 AChE 变化的敏感性。以前的研究发现，过量的活性氧（ROS）如过氧化氢（H₂O₂）会导致细胞内氧化还原失衡，不可避免地引发细胞凋亡，这涉及 AChE 水平的变化。在此，H₂O₂被选为细胞刺激剂来构建凋亡细胞模型。正如预期的那样，用 H₂O₂预处理的细胞表现出增强的荧光，表明凋亡时 AChE 表达上调。同样，新斯的明可以有效地减少红色荧光，进一步证实增加的荧光归因于细胞凋亡期间 AChE 的过度活性。这些数据表明，QXMC 可能被用作研究凋亡与 AChE 之间关系的有前途的候选者。
斑马鱼体内内源性乙酰胆碱酯酶（AChE）表达的可视化研究
斑马鱼因其与人类具有显著的遗传相似性，已被广泛用作研究人类神经系统疾病的强大脊椎动物模式生物1。特别是与神经发育密切相关的乙酰胆碱酯酶（AChE）在斑马鱼胚胎中高度表达2。受神经元细胞中令人满意的成像结果的鼓舞，我们接下来利用 QXMC 可视化活体斑马鱼体内内源性 AChE 的波动。仅用 PBS 处理的 3 日龄斑马鱼胚胎未显示荧光信号。用 QXMC 孵育 30 分钟后，检测到清晰的红色发射，表明 QXMC 与斑马鱼体内存在的内源性 AChE 发生了激活反应。然而，用新斯的明和 QXMC 共同处理的斑马鱼几乎没有荧光，这进一步证实了该荧光是由 QXMC 对斑马鱼体内 AChE 的响应所产生的。监测了由 H₂O₂（作为凋亡刺激物）诱导的斑马鱼体内 AChE 水平。正如预期的那样，用 H₂O₂预处理的斑马鱼在视前神经丘、后神经丘和斑马鱼卵黄囊周围表现出令人信服的荧光增强，表明在凋亡过程中这些区域的 AChE 水平升高。与细胞成像结果类似，新斯的明可通过抑制 AChE 活性有效消除该荧光信号。值得指出的是，加入 QXOH 后，在斑马鱼中观察到相对均匀的荧光，表明 QXOH 的分布均匀。有趣的是，用 QXMC 染色的斑马鱼显示出不均匀的荧光分散，这可能归因于 AChE 在斑马鱼中的特殊不均匀分布。因此，上述结果表明，QXMC 可以有效地检测斑马鱼体内内源性 AChE 的波动，使其成为研究 AChE 在发育生物学中功能的潜在成像工具。
急性癫痫小鼠大脑中 AChE 的可视化
受 QXMC 在细胞和斑马鱼中特异性成像内源性 AChE 的成功应用所启发，我们尝试进一步探索 QXMC 对活体动物大脑中 AChE 水平的影响。众所周知，血脑屏障（BBB）是探针实现脑成像的主要挑战。幸运的是，如果小分子具有某些合适的理化性质，它们可以通过被动扩散穿过 BBB。在此，使用 ChemBioDraw 14.0 估计 QXMC 的 C log P 值为 1.478，表明其具有合适的亲脂性，有可能穿透 BBB3。然后通过尾静脉向健康小鼠注射 QXMC，并使用 IVIS 成像系统捕获小鼠的实时活体荧光图像，以观察 QXMC 的 BBB 穿透能力。正如预期的那样，我们发现 QXMC 在大脑中发出清晰的荧光，这表明 QXMC 可以有效穿透 BBB 并与健康大脑中具有一定活性的 AChE 发生反应。值得注意的是，近红外荧光信号在注射后 1 分钟已达到最大值，并在 40 分钟内逐渐减弱。同时，小鼠的其他部位几乎没有荧光发射，证实了 QXMC 在体内脑成像的巨大潜力。
为了确认探针的 BBB 穿透能力，解剖了健康小鼠（通过尾静脉注射 QXMC 1 分钟）和空白小鼠（未进行 QXMC 处理）的大脑，并分离嗅球、海马、大脑皮层、脑干和小脑皮层进行离体荧光成像。与空白组相比，QXMC 处理小鼠的每个脑组织区域都显示出明显增强的荧光，尤其是大脑皮层、脑干和小脑皮层，进一步为 QXMC 优异的 BBB 穿透能力提供了支持。
通过皮下注射戊四唑（PTZ，一种临床急性癫痫药物）构建了广泛使用的急性癫痫小鼠模型，而空白小鼠则注射相同量的生理盐水。此外，姜黄素（一种具有抗氧化和抗炎作用的神经保护剂，可以有效减轻癫痫发作和神经元损伤）被用于治疗癫痫小鼠。在注射 QXMC 后 1 分钟捕获小鼠的体内荧光图像。具体而言，与未进行 QXMC 处理的空白小鼠中可忽略的荧光相比，健康小鼠中观察到强烈的荧光，这归因于大脑中的内源性 AChE 表达，而癫痫大脑中的荧光信号显著降低，表明在 PTZ 诱导的急性癫痫发作期间 AChE 活性降低。这也表明 QXMC 具有通过监测 AChE 变化，以快速灵敏地区分癫痫小鼠和健康小鼠的潜力，方法是通过近红外荧光成像。与癫痫组相比，姜黄素处理小鼠的大脑荧光强度显著增强，表明癫痫发作的缓解伴随着 AChE 活性的增加。显然，QXMC 可以通过记录 AChE 变化有效地监测这一现象，为体内观察药物干预对癫痫改善的作用提供了支持。然后在注射 QXMC 后 1 分钟处死小鼠，并分离大脑进行离体荧光成像。与体内成像结果一致，离体的癫痫组大脑显示出降低的荧光信号，并且姜黄素可以缓解小鼠的癫痫发作。
总结
通过将 N,N - 二甲基氨基甲酰基引入喹啉-- 呫吨骨架中，我们设计了一种近红外荧光探针 QXMC，用于实时原位成像活神经元细胞、斑马鱼以及非侵入性活体动物（尤其是癫痫小鼠大脑）中的乙酰胆碱酯酶（AChE）通量。QXMC 对 AChE 表现出优异的选择性和极高的灵敏度（检测限低至 8.56 mU/mL，与以往探针相比达到最低水平）。令人惊讶的是，与目前已报道的探针相比，QXMC 的响应时间最快（0.5 秒内）。结合 QXMC 和共聚焦荧光成像技术，我们证实了在细胞凋亡或氧化应激过程中，活细胞和斑马鱼体内的 AChE 会过度表达。最重要的是，借助 QXMC 卓越的血脑屏障（BBB）穿透能力，我们首次发现急性癫痫小鼠大脑中的 AChE 活性降低，而姜黄素治疗癫痫后 AChE 水平得以恢复，这使得 QXMC 成为推动癫痫发病机制研究和治疗的有效成像工具。我们还展望，QXMC 可拓展至其他 AChE 相关神经系统疾病的早期诊断、治疗评估和药物筛选，这可能进一步加速新型可激活探针的开发，以应用于实际生物医学领域。
参考文献
A Near-Infrared Fluorescent Probe for Visualization of Acetylcholinesterase Flux in the Acute Epileptic Mice Brain,Li Fan,* Rui Wang, Qi Zan, Kunyi Zhao, Yuewei Zhang, Yunong Huang, Xue Yu,* Yongming Yang, Wenjing Lu, Shaomin Shuang, Xihua Yang,* and Chuan Dong*, Chem. Biomed. Imaging 2025, 3, 332−340,https://doi.org/10.1021/cbmi.4c00058
