内容提要
本研究报道了一种新型的 pH 依赖性水溶性 SO₂供体 —— 苯并噻唑亚磺酸盐（BTS）。BTS 在生理 pH 条件下能够缓慢且持续地释放SO₂。我们还将其血管舒张特性与纯正的 SO₂气体溶液进行了对比研究。BTS 的缓慢释放特性使其有望成为研究内源性生成的 SO₂的有用工具。
供体的设计
在我们之前的研究中，发现甲基磺酰基苯并噻唑（MSBT）是一种有效的硫醇封闭试剂。它会在 C2 位选择性地与硫醇（-SH）或过硫醇（-S-SH）反应，形成相应的取代加合物，并释放甲基亚磺酸作为副产物。这些结果表明 MSBT 上 C2 位具有强亲电性。我们设想，如果将亚磺酸酯基团连接到苯并噻唑或类似杂环系统的 C2 位上，它可能会在水溶液中发生自发的自消除反应，从而释放出SO₂。
供体的制备
苯并噻唑亚磺酸钠（BTS）通过已知的甲基亚磺酸盐一步制备而成。BTS 为白色结晶固体，在 - 20°C 下可储存六个月以上且不分解，水溶性极佳（高达 100 mM）。BTS 在水溶液中会缓慢分解，生成的唯一产物是苯并噻唑，这表明有SO₂放出来。
二氧化硫供体释放二氧化硫的研究
我们仔细研究了 BTS 的分解情况（即二氧化硫的生成），在缓冲体系中进行了相关实验。通过高效液相色谱（HPLC）和紫外光谱法可以轻松监测 BTS 向苯并噻唑的彻底转化。图中描述了 BTS 在 pH 5.0 磷酸盐缓冲液中的转化情况。研究发现，在酸性条件下（pH 4 或 5），BTS 向苯并噻唑的转化显著增强，几小时内即可完成。在中性 pH（7.4）条件下，反应则慢得多，但仍可观察到。我们还测试了 BTS 与潜在亲核试剂（如半胱氨酸和赖氨酸）的反应，但未观察到任何反应（数据未显示）。二氧化硫的缓慢释放是其在生物学应用中的一个独特且理想的特性，因为这更可能模拟内源性释放。它还可以提供稳定且持续的二氧化硫供应，以维持所需的二氧化硫浓度。
我们还证实了该反应中二氧化硫的释放。为此，我们使用了一种已知的比率型荧光探针 Mito-Ratio-SO₂。以亚硫酸氢钠（NaHSO₃）作为阳性对照，在 37°C 下将 BTS（1 mM）在各种缓冲液中孵育 1 小时后，对二氧化硫的释放量进行了测量。再次观察到 pH 依赖性，在酸性条件下释放的二氧化硫更多。还发现二氧化硫的释放具有时间依赖性，其浓度随时间增加。
为了进一步证实 BTS 在缓冲体系中会产生二氧化硫气体，我们设计了一个二氧化硫气体捕获实验。水合二氧化硫与二氧化硫气体之间的平衡具有 pH 依赖性，在酸性条件下，平衡有利于生成二氧化硫气体。我们的实验正是利用了这一平衡。将 5 mM 的 BTS 或亚硫酸氢钠溶液置于一个密封的 20 mL 玻璃小瓶中。另将一个含有 1.2 mL pH 7.4 PBS 缓冲液和一张滤纸的离心管放入该小瓶中，以捕获蒸发的二氧化硫气体。在 37°C 下孵育 24 小时后，取 1 mL 捕获溶液用 3 mL PBS 缓冲液稀释，并加入 20 μL 2 mM 的 Mito-Ratio-SO₂（最终浓度为 10 μM）。然后测量荧光强度（激发光波长为 405 nm），并计算 481 nm 与 651 nm 处的比率强度。阴性对照仅包含 PBS 缓冲液和 Mito-Ratio-SO₂。捕获溶液中的比率荧光增强，清楚地表明供体会释放出二氧化硫气体。有趣的是，BTS 释放二氧化硫的能力显著高于亚硫酸氢钠，这表明 BTS 直接释放的是二氧化硫气体，而非水合亚硫酸盐衍生物。
供体的血管舒张作用
我们对其血管舒张活性进行了研究。在本研究中，先用 1 μM 去甲肾上腺素预处理大鼠胸主动脉环以诱导收缩。然后，用浓度范围为 250 μM 至 4 mM 的 BTS 处理主动脉环。测量施用 BTS 前后的张力，并以与预收缩主动脉环的最大张力相比的舒张百分比来表示。结果显示，大鼠主动脉环的舒张具有浓度依赖性，在 4 mM BTS 时舒张率接近 70%。我们还研究了在释放二氧化硫后，预期剂量的苯并噻唑对血管舒张的影响。如图所示，苯并噻唑并未引起任何舒张。为了比较二氧化硫气体与 BTS 的血管舒张作用，用 2 mM 二氧化硫或 2 mM BTS 处理大鼠主动脉环，并在处理后测量张力。结果显示，施用二氧化硫气体诱导的舒张程度大于 BTS。这可以解释为，作为一种缓慢释放的供体，BTS 在此过程中仅释放极少量的二氧化硫。然而，使用 BTS 后，舒张的恢复速度比使用二氧化硫慢得多，这表明由于 BTS 的缓慢释放特性，其可能具有持久的活性。
总结
本研究发现了一种水溶性二氧化硫供体 ——BTS。该供体在水溶液中具有缓慢且依赖 pH 的二氧化硫释放能力。它在大鼠主动脉环中还表现出类似二氧化硫的血管舒张作用。
参考文献
Benzothiazole Sulfinate: a Water-Soluble and Slow-Releasing Sulfur Dioxide Donor，Jacob J. Day, Zhenhua Yang, Wei Chen, Armando Pacheco,and Ming Xian*,ACS Chem. Biol. 2016, 11, 1647−1651,DOI: 10.1021/acschembio.6b00106
