内容提要
本研究开发一种比率荧光纳米探针 CNPs@cRGD，它在第一 / 第二近红外（NIR-I/NIR-II）窗口发射双通道荧光（F₇₁₅和 F₁₀₄₅），能够对脑内 H₂S 水平进行精确的比率荧光成像，从而为癫痫的诊断提供便利。CNPs@cRGD 是通过将 H₂S 特异性 NIR-I/NIR-II 比率报告分子 Cy-NO₂负载到环精氨酸 - 甘氨酰 - 天冬氨酸（cRGD）功能化载体 DSPE-mPEG-cRGD 上而获得的。cRGD 修饰显著增强了 CNPs@cRGD 的血脑屏障（BBB）穿透能力和颅内积累，从而有助于其响应脑内病理性 H₂S 水平而产生灵敏的荧光比率（F₇₁₅/F₁₀₄₅）增强。通过整合近红外荧光的深层组织穿透性、比率信号的高保真度以及 cRGD 介导的脑靶向性，CNPs@cRGD 实现了对癫痫发作和进展过程中脑内 H₂S 波动的精确且定量的可视化。
CNPs@cRGD 的设计与制备
通过酯化反应将 4 - 硝基苯甲酰基引入中位羟基七甲川花菁，得到硫化氢特异性报告分子 Cy-NO₂。Cy-NO₂具有独特的近红外 II 区光学特性，在 850 nm 和 1010 nm 附近有两个特征吸收峰，在 1060 nm 处有强荧光发射，这归因于其刚性且广泛的 π 共轭体系。当遇到高浓度硫化氢时，硫化氢的高亲核性和反应性会触发 Cy-NO₂骨架中 4 - 硝基苯甲酸酯的快速断裂，释放烯醇式七甲川花菁，并通过酮 - 烯醇异构化同时形成 Cy - 酮产物，导致 1060 nm 处的荧光强度快速下降，745 nm 处的荧光强度增加且吸收发生明显蓝移。在硫化氢作用下，Cy-NO₂的荧光比率（F₇₄₅/F₁₀₆₀）显著增强约 551 倍。与现有的硫化氢响应荧光探针相比，该比率探针的成像对比度显著提高，其近红外 I/II 区双通道比率信号变化有助于实现对硫化氢的高灵敏检测。考虑到血脑屏障的存在以及小分子在生物体内的快速清除会阻碍 Cy-NO₂检测颅内硫化氢水平，因此采用 cRGD 功能化载体（包含 DSPE-mPEG 和 DSPE-mPEG-cRGD）制备脑靶向纳米探针 CNPs@cRGD。该设计不仅保留了分子探针 Cy-NO₂优异的比率成像性能，还赋予纳米探针穿越血脑屏障的能力，有望实现对颅内硫化氢水平的灵敏检测。我们首先研究了 CNPs@cRGD 的形态特征。由于包含 Cy-NO₂和 mPEG-DSPE 的多组分体系具有自组装倾向，纳米探针 CNPs@cRGD 在水溶液中易制备为单分散纳米颗粒。如图所示，CNPs@cRGD 的动态光散射（DLS）尺寸为 43 nm。透射电子显微镜（TEM）进一步证实了其形态特征，显示为球形，粒径分布均匀，直径为 14±2 nm。此外，游离的 hCy-NO₂由于其骨架中带正电的季铵基团，zeta 电位为 19.2 mV。经相应载体包裹后，CNPs 和 CNPs@cRGD 的 zeta 电位分别为 - 7.4 mV 和 - 9.6 mV，这归因于带负电的 DSPE-mPEG（zeta 电位为 - 11.8 mV）。
CNPs@cRGD 的体外光谱特性
CNPs@cRGD 在 890 nm 附近有宽吸收峰，且在硫化氢作用下，890 nm 处的吸收峰显著降低。同时，CNPs@cRGD 在 PBS 溶液中在 1045 nm 处有强近红外 II 区荧光（Φ=0.1%），在 715 nm 处荧光较弱（Φ=0.12%）。与硫化氢孵育后，CNPs@cRGD 在 1045 nm 处的荧光强度明显降低（Φ=0.01%），同时在 715 nm 处的荧光显著增强（Φ=3%）。此外，CNPs@cRGD 的近红外荧光图像初始显示 715 nm 处荧光可忽略不计，1045 nm 处荧光明亮。这种双通道荧光的显著变化归因于在硫化氢介导的亲核取代作用下，具有大 π 共轭体系的 Cy-NO₂转化为具有相对较短 π 共轭体系的 Cy - 酮。值得注意的是，荧光比率（F₇₁₅ₙₘ/F₁₀₄₅ₙₘ）从 0.015 显著增加到 4.062，增强了 270 倍，表明其对硫化氢检测具有高灵敏度和准确性。受 CNPs@cRGD 优异传感性能的启发，我们进一步研究了其检测硫化氢水平的能力。加入硫化氢后，CNPs@cRGD 在 715 nm 处的荧光强度迅速增加，并在 10 分钟内达到稳定，表现出快速的反应动力学，能够实现对气体信使硫化氢的即时检测。随后，研究了 CNPs@cRGD 对梯度浓度硫化氢的荧光响应。随着 NaSH 浓度的增加，CNPs@cRGD 在 890 nm 处的特征吸光度持续降低。同时，1045 nm 处的荧光强度逐渐降低，而 715 nm 处的荧光强度逐渐增加，在 400 μM NaSH 时达到稳定。此外，在低浓度硫化氢（0-50 μM）下，715 nm 和 1045 nm 处的荧光强度均表现出良好的线性关系。得益于荧光比率（F₇₁₅/F₁₀₄₅）提供的精确量化，CNPs@cRGD 的检测限低至 1.5 μM，确保了硫化氢检测的高准确性和灵敏度。
细胞中硫化氢的荧光成像
我们进而评估了其检测活细胞中硫化氢水平的能力。首先在大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤（PC12）细胞和海马神经元（HT22）细胞中评估了 CNPs@cRGD 的生物相容性。与 CNPs@cRGD 孵育 24 小时后，PC12 和 HT22 细胞的存活率均保持在 90% 以上，表明其具有良好的生物相容性，有潜力用于进一步的细胞成像应用。随后，评估了 CNPs@cRGD 检测细胞内硫化氢的能力。对 PC12 细胞进行不同处理后，与 CNPs@cRGD 孵育并进行共聚焦荧光成像。与 CNPs@cRGD 孵育后，PC12 细胞在细胞质中显示出相对较弱的荧光信号，这是由于 CNPs@cRGD 被有效内吞，且 PC12 细胞内源性硫化氢水平相对较低。在经外源性 NaSH 预处理的 PC12 细胞中，细胞内荧光强度显著增加，是对照组的 2 倍，表明 CNPs@cRGD 对细胞内硫化氢具有优异的荧光响应。相比之下，经 N - 乙基马来酰亚胺（NEM，一种公认的硫醇清除剂）预处理的 PC12 细胞几乎没有荧光。此外，与未处理细胞相比，经氯化锌（一种硫化氢清除剂）预处理的 PC12 细胞的荧光信号显著受抑。共定位分析显示，CNPs@cRGD 的信号与线粒体有很强的重叠。这些发现证实，CNPs@cRGD 可通过内吞作用进入细胞，并通过灵敏的荧光成像实现对细胞内硫化氢的选择性检测。研究人员利用纳米探针 CNPs@cRGD 监测活细胞中的内源性硫化氢水平。在哺乳动物细胞中，硫化氢主要来源于半胱氨酸（Cys）和高半胱氨酸在胱硫醚 γ- 裂合酶（CSE）、胱硫醚 β- 合成酶（CBS）和 3 - 巯基丙酮酸硫转移酶（3-MST）介导下的生物转化。首先，评估了 CNPs@cRGD 在细胞水平上灵敏检测 CSE 相关生理事件中硫化氢的能力。L - 半胱氨酸可有效促进内源性硫化氢的生物合成。与纳米探针 CNPs@cRGD 处理的 PC12 细胞相比，经 L - 半胱氨酸预处理的细胞中观察到强荧光，表明细胞内硫化氢水平升高。DL - 炔丙基甘氨酸（PAG）是 CSE 的特异性抑制剂，可有效阻断 L - 半胱氨酸生成硫化氢的生物合成。正如预期的那样，经 PAG 处理的 PC12 细胞几乎没有荧光，证实 CNPs@cRGD 能够灵敏检测细胞内硫化氢水平。此外，炎症可诱导细胞应激，从而激活细胞内的保护机制。随后研究了脂多糖（LPS）诱导的细胞炎症过程中硫化氢的波动。值得注意的是，经 LPS 处理的 PC12 细胞显示出强烈的荧光，加入 L - 半胱氨酸后荧光进一步增强，与未处理细胞相比增加了 2.5 倍。此外，经 PAG 和 LPS 处理的细胞内荧光几乎受抑，这表明 LPS 处理可触发 CSE 表达上调并促进细胞内硫化氢的产生。随后，将 CNPs@cRGD 应用于检测 PC12 细胞中 CBS 介导的生理事件中的硫化氢水平。用激活剂 S - 腺苷 - L - 甲硫氨酸（SAM）或 CBS 抑制剂氨基氧乙酸半盐酸盐（AOAA）刺激细胞，以调节 CBS 活性和内源性硫化氢水平。经 SAM 预处理的细胞显示出明显强烈的荧光，荧光强度是未处理细胞的 2.2 倍。相比之下，经 AOAA 预处理的 PC12 细胞的荧光明显受抑，与未处理细胞相比降低了 50% 以上。在不同条件下的 HT22 细胞中观察到类似的荧光趋势，表明纳米探针 CNPs@cRGD 在不同细胞系中检测硫化氢相关生理事件的精确性和普遍性。这些发现充分验证了 CNPs@cRGD 在追踪和检测硫化氢波动方面的优异性能，为研究硫化氢相关病理事件及其潜在机制提供了有力工具。
PTZ 诱导的细胞损伤模型中细胞内硫化氢的荧光成像
在 PTZ（一种诱发癫痫的药物）刺激的 PC12 细胞中进行了荧光成像。按照图所述的步骤，将 PC12 细胞与预设浓度的 PTZ 孵育，随后在不同时间点给予 CNPs@cRGD。细胞内的荧光信号先升高后逐渐降低。用 0.5 mM PTZ 处理后 12 小时，荧光强度达到峰值，与对照组相比增加了 2 倍。PTZ 处理 24 小时后，荧光强度比 PTZ 处理 12 小时时降低约 30%。此外，PTZ 处理 12 小时后，随着 PTZ 浓度的增加，细胞内荧光强度逐渐增加，表明不同浓度的 PTZ 可刺激内源性硫化氢水平升高。细胞内荧光强度的统计分析进一步验证了内源性硫化氢水平的波动。值得注意的是，与先前的报道一致，在癫痫发作期间，硫化氢 / CBS 通路可被激活以减轻神经元损伤。
癫痫发作期间硫化氢波动的近红外 I/II 区比率荧光成像
受 CNPs@cRGD 优异的脑靶向性能的启发，我们进而评估了其在不同程度癫痫小鼠脑组织中原位监测硫化氢水平的潜力。戊四氮（PTZ）是一种有效且选择性的 GABAA 拮抗剂，已被广泛用于在药理学动物模型中诱发癫痫。通过腹腔注射 PTZ 一天或两天，建立了不同严重程度的癫痫小鼠模型。采用 Racine 分级标准确认癫痫模型的成功建立。PTZ 2 天组的癫痫发作严重程度高于 PTZ 1 天组。对 PTZ 诱导的癫痫小鼠和健康小鼠经尾静脉注射 CNPs@cRGD 进行体内成像。在整个成像过程中，健康小鼠脑部区域在 1045 nm 通道有可观察到的荧光信号，在 715 nm 处荧光可忽略不计，表明正常脑组织中硫化氢含量极低。值得注意的是，在脑部观察到荧光信号，强调了纳米探针优异的脑靶向特性，并突出了近红外 II 区荧光在深层组织生物成像应用中的可靠性和灵敏度。在接受单剂量 PTZ 的小鼠中，颅内 1045 nm 处的荧光几乎消失，而在脑部可清晰观察到 715 nm 处的强荧光信号。同时，715 nm 处的荧光随时间逐渐增加，并在注射 CNPs@cRGD 后 0.5 小时达到最大值，表明接受单剂量 PTZ 的小鼠脑内硫化氢水平上调。这种现象可能与硫化氢介导的神经保护机制有关，特别是其在对抗氧化应激和维持细胞内氧化还原稳态方面的功能。与单剂量 PTZ 组相比，接受两剂量 PTZ 的小鼠在 715 nm 处的荧光显著降低，同时 1045 nm 处的荧光显著增加，表明重度癫痫时脑内硫化氢水平下调。这可能与癫痫症状加重有关。对取出的大脑进行离体成像证实，荧光信号主要来源于脑组织，与体内图像一致。对颅内荧光强度的定量分析显示，接受单剂量 PTZ 的小鼠在 715 nm 处的荧光约为 PBS 处理小鼠的 1.8 倍，为接受两剂量 PTZ 的小鼠的 2.6 倍。此外，接受单剂量 PTZ 的小鼠脑部的荧光比率 F₇₁₅/F₁₀₄₅是正常小鼠的 3 倍，是接受两剂量 PTZ 的小鼠的 5 倍。值得注意的是，与单一荧光分析相比，荧光比率 F₇₁₅/F₁₀₄₅表现出更高的信噪比，证实了比率荧光成像在提高检测特异性和灵敏度方面的优势，并为体内精确成像提供了更可靠的分析方法。为进一步研究硫化氢在轻度癫痫发作期间在抗氧化防御系统（ADS）中的作用，通过体内近红外 I/II 区荧光成像评估了不同剂量 PTZ 处理的小鼠体内内源性硫化氢水平。健康小鼠相比，PTZ 处理的小鼠脑部区域在 715 nm 处的荧光信号显著增加。综合统计分析表明，F₇₁₅/F₁₀₄₅荧光比率与 PTZ 给药呈剂量依赖性正相关，表明轻度癫痫发作期间硫化氢水平上调。此外，癫痫发作与氧化应激密切相关。
总结
我们开发了一种智能近红外 I/II 区（NIR-I/NIR-II）比率荧光纳米探针 CNPs@cRGD，用于原位监测癫痫发作期间硫化氢（H₂S）的波动。该纳米探针通过将近红外 I/II 区比率报告分子 Cy-NO₂与 cRGD 功能化脂质体整合而构建。CNPs@cRGD 对 H₂S 表现出独特的近红外 I/II 区比率荧光响应（F1045→F715），具有超高灵敏度和高信噪比成像能力，增强倍数高达 270 倍。此外，凭借其更深的组织穿透性、优异的灵敏度和脑靶向能力，CNPs@cRGD 能够监测不同严重程度癫痫中的 H₂S 波动，实现高对比度成像并对早期轻度癫痫进行准确诊断。这些发现表明，轻度癫痫中由于抗氧化防御系统（ADS）的激活，H₂S 水平上调；而重度癫痫中由于炎症性氧化应激，H₂S 水平下调。
参考文献
Brain-targeted NIR-I/NIR-II ratiometric fluorescence nanoprobe for in situ monitoring of dynamic H2S fluctuations during epileptic seizures,Xueqian Chen, Yu Guo, Yong Zhang, Jiatian Liu, Pan Li,Chem. Eng. J,https://doi.org/10.1016/j.cej.2025.166944
