内容提要
单酰基甘油脂肪酶（MAGL）是内源性大麻素系统中负责信号终止的关键分解代谢酶。在治疗癌症、代谢紊乱和炎症性疾病时，抑制 MAGL 相比直接激活大麻素受体具有独特优势。本研究通过将高荧光性的硼 - 二吡咯亚甲基（BODIPY）部分整合到能与 MAGL 活性位点相互作用的抑制剂结构中，开发出了靶向 MAGL 的荧光探针。这些荧光探针具有良好的类药物特性，如高溶解度和渗透性、对不同物种的 MAGL 均有皮摩尔级效力，以及高细胞选择性和特异性。
小型化荧光单酰基甘油脂肪酶探针的合成与光物理性质
为了获得所需的 BODIPY 荧光探针，我们建立了一种全面的模块化策略来合成 8 - 亚烷基连接的结构。该策略采用乙烯基硼酸与8-硫甲基-BODIPY 构建块之间的 Liebeskind-Srogl 交叉偶联（LSCC）作为核心步骤。研究发现，通过螺环部分将构象柔性限制在活性构象中，是增强亲和力的有效策略。与单酰基甘油脂肪酶活性位点的两亲性子口袋相互作用的头基的取代，是以模块化且独立的方式进行的。这一现象归因于中央羰基通过与丝氨酸水解酶的氧阴离子洞形成键，从而稳定了结合构象。最有效和最有前景的化合物，经过了全面表征，包括生化活性、选择性、细胞效力、类药性和物理化学性质以及光物理性质。
在细胞和组织层面的实验中，将探针荧光红移至更长波长是非常理想的，因为这可以减少来自生物自发荧光和组织吸收的干扰。因此，我们希望通过对 BODIPY 荧光团的 3 位进行取代来诱导红移，同时又不会显著破坏蛋白质与配体的相互作用模式。特别是，吡咯 - 2 - 基取代的 BODIPY 应该能够诱导强烈的红移，还可能进一步应用于超分辨率显微镜。因此，我们结合最有前景的两亲性头基，对这种取代方式进行了研究（1a、2a、4a、5a）。所得到的 3 - 吡咯基取代的 BODIPYs 对 MAGL 的亲和力几乎与未取代的类似，但与它们未取代的 BODIPY 同系物 1、2、4 和 5 相比，显示出显著的光谱红移。我们观察到，所有 3 - 吡咯基取代的 BODIPY 衍生物的发射波长红移了 86 nm（594 nm 对 502 nm），斯托克斯位移也有所增加（24 nm 对 13 nm）。尽管这些取代结构没有达到对称 BODIPYs 的高亮度和量子产率（Φ=2.0-5.7% 对 56.6-87.8%），但我们发现它们在活细胞的细胞成像应用中具有足够的成像能力。对称的 BODIPY 类似物（1、2、3、4、5）和 3 - 吡咯基取代的探针（1a、2a、4a、5a）都可以使用容易获得的滤光片组，分别如异硫氰酸荧光素（FITC）和花青 3（Cy3）的滤光片组。
选择性竞争性单酰基甘油脂肪酶结合测定法的开发
与目前唯一可用的单酰基甘油脂肪酶（MAGL）选择性荧光共价探针 LEI-463 不同，探针 3、4、4a、5 和 5a 是稳定、无反应性且可逆的 MAGL 配体。尽管在我们的研究中未观察到，但共价探针始终存在非特异性反应或过度代谢的风险。此外，与不可逆探针相比，使用可逆探针能够开展各种竞争性结合测定，并且其可用性有利于多种实验场景。因此，我们着手研究可逆硼 - 二吡咯亚甲基（BODIPY）荧光探针 5 作为 MAGL 荧光偏振（FP）结合测定法中示踪剂的能力。这种 FP 结合测定法将是对已描述的功能性酶测定法的极有用补充，且不需要放射性标记的报告分子，从而使操作更加便捷。
小型化探针具有适用于 FP 的理想特性：低分子量，使结合态和未结合态之间的偏振差异较大；明亮的 BODIPY 荧光团，具有适当的荧光寿命；荧光团在结合口袋内牢固固定，无旋转自由度，避免因所谓的 “螺旋桨效应” 而发生去偏振。这产生了强烈的各向异性效应，ΔFPmax>350 毫偏振，接近理论最大值。探针 5 的 Kd 常数经测定为 6.65 nM，能够根据 Nikolovska-Coleska 等人的方法在竞争测定场景中测量非标记 MAGL 抑制剂的 Ki 值。我们研究了三种广泛使用的 MAGL 候选药物，其中包括两种不可逆抑制剂。需要注意的是，所有测定均具有时间依赖性，且不同测定之间的 IC50 和 Ki 值不能直接比较：PF（Ki=12.8±3.9 nM）和 ABX-1431（Ki=44.3±2.2 nM），以及最著名的可逆 MAGL 抑制剂 JNJ-42226314（Ki=18.5±3.3 nM，这与通过荧光发生测定法确定的 20±3 nM 的报告 K1 值高度一致）。因此，这种 FP 结合测定法能够在简单的标准测定布局（384 孔板，z'=0.90）中准确测定可逆 MAGL 抑制剂的 Ki 值，适用于高通量筛选。
除了无细胞 FP 测定法外，我们还在 nanoBRET 测定法中利用了荧光探针的可逆非共价结合机制。吡咯取代的 BODIPY 探针4a被用作活的 HEK293 细胞中的示踪剂，因为这种 BODIPY 荧光团的光谱特性与荧光素酶作为供体 - 受体对的配对最佳。在此，4a无需对标准测试条件进行进一步修改即可使用，这使得能够测定细胞中 MAGL 抑制剂的靶点结合情况。从而可以评估 MAGL 抑制剂的细胞 IC50 值。例如，MAGL 抑制剂 PF 的细胞 IC50 经测定为 1.60μM。
流式细胞术和共聚焦成像在天然表达单酰基甘油脂肪酶的活细胞系统中的应用
流式细胞术是分子生物学、病理学和生理学领域广泛用于分析细胞群体的技术。它依赖于对目标蛋白质结构或过程的特异性荧光标记。对于不在表面表达的细胞内蛋白质而言，这可能具有挑战性。标记物可能无法到达蛋白质靶点，或者在细胞内发生非特异性积累。为了研究我们的探针是否能检测到天然表达的单酰基甘油脂肪酶，我们将人结直肠腺癌 HT-29 细胞与不同浓度的共价探针 1 共同孵育，并通过流式细胞术分析染色情况。使用探针 1 的这项分析能够在 5μM 的较高浓度下清晰检测到单酰基甘油脂肪酶阳性的 HT-29 癌细胞。通过用不可逆单酰基甘油脂肪酶选择性抑制剂 PF 预孵育，该荧光信号被显著阻断，这证实了探针 1 在活细胞流式细胞术中的特异性。与后续的成像应用相比，此处使用较高的探针浓度是为了获得最佳的单酰基甘油脂肪酶特异性信号。这可能是由于在这种特定的流式细胞术设置中存在非特异性细胞积累，因为我们在 1μM 浓度下未观察到信号显著降低。然而，据我们所知，迄今为止尚未有使用小分子探针通过流式细胞术对活的、天然单酰基甘油脂肪酶阳性细胞进行单酰基甘油脂肪酶特异性检测的报道。
接下来，我们进行了共聚焦成像实验，以研究单酰基甘油脂肪酶在 HT-29 细胞人非小细胞肺癌细胞系 A549中的定位。可逆探针5和不可逆探针 1 均非常适合这项共聚焦成像研究。我们在 150nM 浓度下就已在两种细胞系中观察到明亮且稳定的单酰基甘油脂肪酶染色。在这种低浓度下，无需洗涤步骤即可有效可视化单酰基甘油脂肪酶。我们能够在数秒至数分钟内监测探针的摄取以及在细胞内区室中发生的染色过程。这一观察结果证明了本研究中所用探针的渗透性。通过比较经单酰基甘油脂肪酶选择性抑制剂 PF 预孵育和未预孵育的细胞之间的荧光强度，证实了探针的单酰基甘油脂肪酶特异性。通过使用探针 1 或 5 与 ER-Tracker red（Invitrogen）进行共染色实验，我们在 HT-29 细胞中检测到单酰基甘油脂肪酶在内质网（ER）中的显著定位（皮尔逊相关系数 r 分别为 0.98 和 0.87）。同时，溶酶体或线粒体追踪剂未显示单酰基甘油脂肪酶在这些区室中的定位。这与先前的研究结果一致3。有趣的是，除了内质网染色外，我们还观察到单酰基甘油脂肪酶在小型球形结构中的密集定位，这些结构可能是脂滴。据报道，脂滴在癌症代谢中起着至关重要的作用，而单酰基甘油脂肪酶是其典型酶之一。
随后，我们探究了我们的探针在更复杂的生物系统中特异性标记单酰基甘油脂肪酶的能力。我们将共价探针 1 应用于活的原代小鼠海马神经元培养物，并在神经元突起中观察到稳定且强烈的单酰基甘油脂肪酶信号。用 PF 抑制剂预孵育后，平均荧光信号显著降低，这证实了探针 1 标记的高靶点特异性。在原代星形胶质细胞中也观察到强烈的单酰基甘油脂肪酶荧光信号。不可逆探针，特别是化合物1，被证明非常稳健，适用于需要大量洗涤步骤的更复杂组织样品的成像应用。
在证明探针1在培养的原代细胞系中的应用后，我们进一步在人诱导多能干细胞（hiPSC）衍生的脑类器官中研究了这些探针。该探针能有效穿透类器官的三维结构，并在类器官中检测到 MAP2 阳性神经元和 MAP2 阴性非神经元细胞中的单酰基甘油脂肪酶。通过用 PF 预孵育，基本上阻断了探针 1 对单酰基甘油脂肪酶的标记，从而证实了 1 的特异性。
结论
在本研究中，我们通过将明亮的荧光报告单元与药物衍生的配体结构融合，开发出了一系列多功能的小型化 MAGL 荧光探针。我们的方法得到了具有高 potency、特异性和类药物特性的探针，适用于各种转化实验。这使得能够通过 SDS-PAGE 凝胶内荧光在细胞或组织裂解物中特异性检测 MAGL，以及通过流式细胞术在活细胞中检测 MAGL。这些探针还助力建立了高通量 FP MAGL 结合测定法，用于在活的天然细胞系、海马神经元培养物和人诱导多能干细胞衍生的脑类器官中染色和定位 MAGL。此外，其中一种荧光探针被转化为双模态荧光 [¹⁸F]-PET 探针，能够在脑组织中特异性且选择性地标记 MAGL。
参考文献
Highly Specific Miniaturized Fluorescent Monoacylglycerol Lipase Probes Enable Translational Research,Axel Hentsch, Mónica Guberman, Silke Radetzki, Sofia Kaushik, Mirjam Huizenga, Yingfang He, Jörg Contzen, Bernd Kuhn, Jörg Benz, Maria Schippers, Jerome Paul, Lea Leibrock, Ludovic Collin, Matthias Wittwer, Andreas Topp, Fionn O’Hara, Dominik Heer, Remo Hochstrasser, Julie Blaising, Jens P. von Kries, Linjing Mu, Mario van der Stelt, Philipp Mergenthaler, Noa Lipstein, Uwe Grether, and Marc Nazaré*,J. Am. Chem. Soc. 2025, 147, 10188−10202,https://doi.org/10.1021/jacs.4c15223
