内容提要
本研究首次将2-巯基-1,3,4-噻二唑（MTD）用作H₂S的新型识别基团，将其与花青染料偶联后得到新型光声探针Cy-MTD。为实现双比率成像，将Cy-MTD整合到下转换纳米颗粒（DCNP）中，构建出开创性的近红外二区荧光/近红外一区光声双比率纳米探针DCNP@Cy-MTD。Cy-MTD与H₂S反应后，吸收峰从840 nm蓝移至670 nm，通过测定670 nm与840 nm处的光声信号比值（PA₆₇₀/PA₈₄₀），可实现H₂S的近红外一区比率光声成像。此外，由于Cy-MTD在约840 nm处有强吸收，且其吸收光谱与DCNP的808 nm激发波段重叠，DCNP@Cy-MTD纳米探针中DCNP在808 nm激发下的荧光发射（F₁₅₅₀nm,₈₀₈Ex）会因竞争性吸收而被淬灭；而与H₂S作用时，因Cy-MTD吸收峰蓝移，该荧光发射得以恢复。以DCNP在980 nm激发下的稳定荧光发射（F₁₅₅₀nm,₉₈₀Ex）作为参考信号，可实现H₂S的近红外二区比率荧光成像（F₁₅₅₀nm,₈₀₈Ex/F₁₅₅₀nm,₉₈₀Ex）。
Cy-MTD的合成及光学性质
以七甲川花青（Cy-Cl）为核心结构，并入MTD作为硫化氢的选择性识别部分，我们首先设计并合成了一种新型比率光声探针Cy-MTD。与Cy-Cl相比，Cy-MTD的吸收峰发生了显著红移，从816 nm移至840 nm，在二甲基亚砜（DMSO）中的摩尔吸光系数为1.1827×10⁵L・mol⁻¹・cm⁻¹。在生理条件下（pH≈7.4），H₂S是主要存在形式。由于NaHS易水解生成H₂S，当加入NaHS作为H₂S供体后，溶液颜色明显从绿色变为蓝色，同时吸收峰从840 nm显著蓝移至670 nm。表明该探针具有比率光声成像能力，Cy-MTD在840 nm处有明显信号，其与H₂S反应的产物在670 nm处有明显信号。
DCNP@Cy-MTD的制备与表征
采用固液热分解法合成了NaYF₄:Er@NaYF₄核壳结构下转换纳米颗粒（DCNP）。透射电子显微镜（TEM）图像显示纳米颗粒分散均匀，平均尺寸约为35 nm。高角环形暗场扫描透射电子显微镜（HAADF-STEM）清晰呈现出核壳结构，壳层厚度约为7.5 nm。DCNP在808 nm和980 nm激光激发下均在1550 nm处表现出强烈的特征荧光发射。在NaYF₄:Er@NaYF₄核壳结构中，Er³⁺作为唯一的发光中心，同时发挥光子吸收体和发射体的作用。Y³⁺作为晶格成分，不直接参与光子吸收或发射，但通过调节晶体场环境增强Er³⁺的发光效率。在808 nm激发下，Er³⁺电子从⁴I₁₅/₂基态跃迁到⁴I₉/₂激发态，随后通过非辐射弛豫到⁴I₁₃/₂亚稳态。在980 nm激发下，电子从⁴I₁₅/₂跃迁到⁴I₁₁/₂，随后非辐射弛豫到⁴I₁₃/₂。最终，Er³⁺发生⁴I₁₃/₂→⁴I₁₅/₂辐射跃迁，发射约1550 nm的近红外光子。
为构建DCNP@Cy-MTD纳米探针，使用两亲性聚合物DSPE-PEG对DCNP表面进行修饰，形成疏水空腔以包埋Cy-MTD分子。DCNP@Cy-MTD的TEM分析显示，与原始DCNP相比，纳米颗粒的尺寸和形貌无显著变化，表明Cy-MTD的负载未影响纳米颗粒的结构完整性。动态光散射（DLS）测量显示，水合直径从DCNP的约51 nm增加到DCNP@Cy-MTD的约73 nm，进一步证实表面修饰和分子包埋成功。DCNP@Cy-MTD的吸收光谱显示出Cy-MTD的特征吸收峰，且Cy-MTD的吸收与DCNP的808 nm激发波段重叠，而与980 nm激发波段不重叠。因此，Cy-MTD可优先吸收808 nm激发能量。单独的DCNP在808 nm激发下于1550 nm处产生强荧光信号，而DCNP@Cy-MTD的信号则被淬灭。这种由吸收竞争诱导发射（ACIE）效应驱动的现象，通过DCNP与Cy-MTD之间的竞争性吸收抑制了荧光信号。同时，在980 nm激发下，DCNP和DCNP@Cy-MTD的荧光强度相近，未观察到淬灭现象。在相同条件（12000 rpm，12 min）下，游离的Cy-MTD保持悬浮状态，而DCNP和DCNP@Cy-MTD则完全沉淀。各组分的荧光成像显示，Cy-MTD不能被808 nm或980 nm激发，而DCNP可被808 nm和980 nm激光激发。然而，与DCNP相比，DCNP@Cy-MTD未观察到808 nm激发的荧光成像信号，这也证实了Cy-MTD与DCNP之间的竞争性吸收在808 nm处产生了ACIE效应。
DCNP@Cy-MTD响应硫化氢的光学性质
向DCNP@Cy-MTD溶液中加入硫氢化钠（50μM），在室温下反应2分钟。随着反应进行，840 nm处的吸光度下降，同时670 nm处出现新的吸收峰并逐渐增强。相应地，光声光谱显示840 nm处的光声信号（PA₈₄₀）强度逐渐降低，而670 nm处的光声信号（PA₆₇₀）强度相应增加。在808 nm激发下，与硫氢化钠孵育后，1550 nm处的荧光信号显著增强，而在980 nm激发下，即使存在硫氢化钠，荧光信号也未发生变化。DCNP或Cy-MTD与硫氢化钠反应前后的荧光光谱未观察到明显差异。这些结果证实，荧光增强是Cy-MTD与DCNP之间吸收竞争诱导发射（ACIE）效应的结果，表明响应硫化氢的荧光/光声双比率纳米探针已成功开发。
接下来，我们探究了DCNP@Cy-MTD纳米探针对不同浓度硫氢化钠的光学响应。随着硫氢化钠浓度升高，840 nm处的吸光度减弱，而670 nm处的吸光度逐渐上升。相应地，在808 nm激发下，1550 nm处的荧光信号逐渐恢复，而在980 nm激发下未检测到显著变化。这些结果证实，该纳米探针对硫氢化钠的光学响应具有浓度依赖性。吸光度比值（Abs₆₇₀/Abs₈₄₀）显著增加，反应后增幅达56倍。吸光度的对数比值（lgAbs₆₇₀/Abs₈₄₀）与硫氢化钠浓度呈线性关系，拟合方程为y=0.02392x−0.6758（R²=0.9835），在0-40μM浓度范围内线性良好，根据3σ规则计算检测限为0.4μM。光声实验进一步证实，硫氢化钠浓度与光声信号强度比值（PA₆₇₀/PA₈₄₀）呈正相关，且随硫氢化钠浓度升高而增加，相应的光声图像如图所示。同样，荧光强度比值（F₁₅₅₀nm,₈₀₈Ex/F₁₅₅₀nm,₉₈₀Ex）随硫氢化钠浓度线性增加，反应后增幅达6.6倍，相应的近红外二区荧光图像如图所示。荧光强度的对数比值（lgF₁₅₅₀nm,₈₀₈Ex/F₁₅₅₀nm,₉₈₀Ex）与硫氢化钠浓度呈线性相关，拟合方程为y=0.01670x−0.7364，相关系数较高（R²=0.9962）。结果表明，在0-50μM硫氢化钠浓度范围内线性关系良好，根据3σ规则计算检测限为0.7μM。这些实验结果证实，该双比率纳米探针能够快速、灵敏地检测硫化氢。
为验证该纳米探针在活体动物中响应外源性硫化氢的能力，进行了近红外二区荧光成像实验。首先向小鼠腹腔注射DCNP@Cy-MTD纳米探针（5 mg/mL，50μL），随后分别在注射部位注射生理盐水和硫氢化钠（50μM）。在980 nm激发下，两个部位均检测到清晰的荧光信号。值得注意的是，在808 nm激发下，硫氢化钠注射部位观察到强荧光信号，而生理盐水注射部位的荧光信号极弱。这表明DCNP@Cy-MTD纳米探针可成功用于体内硫化氢的监测。
在本研究中，我们利用所制备的具有近红外二区荧光/近红外一区光声双比率成像能力的硫化氢响应型DCNP@Cy-MTD纳米探针，对肝炎进行可视化诊断。通过向小鼠腹腔注射脂多糖（LPS，10 mg/kg）建立肝炎模型，24小时后通过尾静脉注射DCNP@Cy-MTD纳米探针（10 mg/mL，200μL）。在特定时间间隔（0.5、1.0、1.5、2.0和2.5小时）采用近红外二区荧光成像和多光谱光声断层成像技术对体内硫化氢水平进行实时监测。在生理盐水处理的对照组中，在整个2.5小时的监测期间，808 nm激光激发下未检测到显著的荧光成像信号，但980 nm激发下的荧光信号明显且稳定。此外，670 nm和840 nm处的光声信号（PA₆₇₀和PA₈₄₀）均保持稳定。相比之下，在脂多糖诱导的肝炎模型组中，808 nm激发下的荧光信号随时间逐渐增强，而980 nm激发下的信号则相对稳定。同时，PA₈₄₀信号减弱，而PA₆₇₀信号显著增强。相应的荧光和光声信号强度如图所示。
我们进一步分析了荧光强度比值（F₁₅₅₀nm,₈₀₈Ex/F₁₅₅₀nm,₉₈₀Ex）和光声强度比值（PA₆₇₀/PA₈₄₀）。对照组中，这些比值未出现显著变化。然而，在脂多糖处理的肝炎组中，这些比值随时间逐渐增加，在2小时时达到峰值，这被确定为荧光和光声成像的最佳时间点。此时，荧光信号比值（F₁₅₅₀nm,₈₀₈Ex/F₁₅₅₀nm,₉₈₀Ex）较初始信号增加了3.6倍，光声信号比值（PA₆₇₀/PA₈₄₀）增加了4.2倍。实验结束后，处死小鼠，取其主要器官（心脏、肝脏、脾脏、肺和肾脏）进行离体荧光成像。结果显示，荧光信号主要集中在肝脏。为进一步量化纳米颗粒在不同器官中的生物分布，进行了电感耦合等离子体质谱（ICP-MS）分析，证实纳米颗粒主要在肝脏中积累，而在脾脏、肺、肾脏和心脏中的含量显著较低。这些发现凸显了荧光/光声双比率纳米探针在监测脂多糖诱导的肝炎中硫化氢水平动态变化方面的实用性，为体内实时检测提供了一种有前景的方法。
总结
我们首次将2-巯基-1,3,4-噻二唑（MTD）用作硫化氢（H₂S）的新型识别基团，将其与花青染料偶联后得到了一种新的光声探针（Cy-MTD）。通过将Cy-MTD与下转换纳米颗粒（DCNP）整合，我们构建出了一种开创性的近红外二区荧光/近红外一区光声双比率纳米探针DCNP@Cy-MTD，该探针能够在体外和体内对H₂S进行实时可视化监测。这种双比率纳米探针有效克服了传统单模态探针的局限性，为H₂S的检测提供了一种更准确、更可靠的成像方法。利用所提出的DCNP@Cy-MTD纳米探针，通过对H₂S进行近红外二区荧光/近红外一区光声双比率成像，实现了肝炎疾病的诊断。
参考文献
A Hydrogen Sulfide-Activated NIR-II Fluorescence/NIR-I Photoacoustic Dual-Ratiometric Nanoprobe With Unique Recognition Reaction for Precise Visual Diagnosis of Hepatitis Disease,Lixian Huang, Fei Lv, Yidong Bin, Jingjin Zhao, Caiying Li, Shulin Zhao,* Shengqiang Hu, and Liangliang Zhang*,Small 2025, 2501269,https://doi.org/10.1002/smll.202501269
