内容提要
在本研究中开发了一种一氧化氮响应探针（NOP）及其纳米制剂（NanoNOP）。NanoNOP 对一氧化氮表现出优异的稳定性、敏感性和选择性，在接触一氧化氮后，其荧光和光声（PA）信号会增强。在细胞研究中，NanoNOP 在泡沫细胞（心血管疾病中的一种关键细胞类型）中显示出强烈的一氧化氮响应性，其光声和荧光信号显著高于对照巨噬细胞。在急性肺损伤（ALI）小鼠的体内研究中，发现主动脉区域的一氧化氮水平升高，这一点通过离体免疫组织化学分析得到证实，该分析显示诱导型一氧化氮合酶（iNOS）的表达和一氧化氮的产生均增加。
NOP与NanoNOP的合成和性质研究
NOP首先是化合物1与三苯胺的Suzuki偶联反应，随后使用 Fe/HCl 将化合物2的硝基还原为氨基，得到化合物 NOP1。在未激活状态下，由于 NOP 分子较弱的分子内电荷转移效应，仅显示短波吸收，溶液呈黄色。当加入 NO 后，分子内电荷转移效应增强，吸收光谱红移，溶液颜色由黄色变为绿色。为改善水溶性较差的 NOP 的生物相容性，我们采用两亲性聚合物二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺 - 甲氧基聚乙二醇（mPEG-DSPE）对其进行包裹，形成 NanoNOP。NanoNOP 的合成步骤如下：将 mPEG-DSPE 溶于氯仿中，减压蒸发形成脂质薄膜；将 NOP 化合物溶于氯仿后加入该脂质薄膜中；用缓冲水溶液水合混合物，使 NOP 包裹在 mPEG-DSPE 形成的胶束内；水合后，对 NanoNOP 混悬液进行超声处理，以确保纳米颗粒均匀分散。采用动态光散射（DLS）测定 NanoNOP 的粒径分布，结果显示其平均粒径约为 30.01 nm。同时，透射电子显微镜（TEM）表征证实，NanoNOP 的粒径为 25-30 nm，呈球形。在合成并表征 NanoNOP 后，我们研究了其在溶液中对 NO 的吸收能力以及荧光和光声（PA）响应。初始状态下，NanoNOP 在近红外（NIR）区域的吸收极小，表明其在此范围内吸收的光量极少。然而，当向溶液中加入 NO 后，在 600-800 nm 之间出现明显且显著的吸收带，吸收峰中心位于 700 nm 左右，表明 NanoNOP 能有效吸收该光谱区域内由 NO 诱导产生的变化。在荧光特性方面，实验条件下 NanoNOP 自身的荧光信号相对较弱。但加入 NO 后，荧光强度显著增加，发射峰移至约 840 nm 处。最后，我们评估了 NanoNOP 在有无 NO 存在时的光声响应。无 NO 时，NanoNOP 在近红外区域的光声信号极小；加入 NO 后，700-750 nm 波长处的光声信号显著增强6。这种光声信号的增强进一步证明 NanoNOP 能够对 NO 产生响应，使其成为 NO 成像和诊断（尤其是体内应用）的潜在候选工具。
利用 NanoNOP 检测溶液中的一氧化氮（NO）
我们重点测试了 NanoNOP 在接触 NO 后其光声和荧光信号的变化。当 NO 浓度从 0 增至 50 μM 时，NanoNOP 的光声信号显著增强。重要的是，光声信号强度与 NO 浓度呈强线性相关，相关系数（R²）为 0.9966，这表明 NanoNOP 可通过光声成像有效用于 NO 的定量检测。接着，我们研究了 NanoNOP 的光热响应 —— 这一与光声信号直接相关的参数。在 660 nm 激光照射下，随着 NO 浓度的增加，NanoNOP 的光热效应明显增强，温度显著升高。这种制热能力的提升与观察到的光声信号增强一致，进一步证实 NanoNOP 在结合 NO 后，其光学特性的变化不仅影响光吸收和发射，还会改变其热学性质。我们研究了 NanoNOP 在不同条件（包括 pH 和温度变化）下对 NO 的响应。当溶液 pH 从 9 降至 4 时，NanoNOP 对 NO 的响应增强。这表明 NanoNOP 在酸性条件下更易与 NO 反应。我们还观察到，当温度从 25°C 升至 40°C 时，NanoNOP 对 NO 的响应也随之增强，这表明较高温度可能会加快反应速度。这些结果表明，NanoNOP 在酸性和较温暖的条件下对 NO 的反应更强烈，这可能会提高其在 pH 或温度变化的传感和治疗应用中的性能。
接下来，我们通过将 NanoNOP 与多种金属离子、活性物质、谷胱甘肽、半胱氨酸及生物酶共同孵育，评估了其对 NO 的响应选择性。具体而言，NanoNOP 暴露于常见金属离子（包括钾离子（K⁺）、铝离子（Al³⁺）和铜离子（Cu²⁺））以及活性氧（如过氧化氢（H₂O₂）、羟基自由基（・OH）和次氯酸（HOCl））中。此外，NanoNOP 还与基质金属蛋白酶（MMPs）和碱性磷酸酶（ALP）等生物酶共同孵育。我们通过将 NanoNOP+NO 产物与各种金属离子、活性物质和生物酶共同孵育，研究了其化学稳定性。与钾离子（K⁺）、铝离子（Al³⁺）、铜离子（Cu²⁺）等金属离子，以及过氧化氢（H₂O₂）、羟基自由基（・OH）、次氯酸（HOCl）等活性物质孵育后，NanoNOP+NO 产物的光声信号几乎没有显著变化。
泡沫细胞中一氧化氮（NO）的成像
为模拟泡沫细胞的形成，我们采用了 RAW264.7 巨噬细胞系，该细胞系因在接触 oxLDL 后可分化为泡沫细胞而常用于动脉粥样硬化研究。实验中，先将 RAW264.7 细胞在标准条件下培养，再与 oxLDL 共同孵育以诱导泡沫细胞形成，随后将 NanoNOP 应用于泡沫细胞培养体系，探究其成像潜力。实验分组如下：1. RAW264.7 细胞（对照组）；2. 泡沫细胞（RAW264.7+oxLDL，阳性组）：将 RAW264.7 细胞与氧化低密度脂蛋白（oxLDL）共同孵育以诱导泡沫细胞形成；3. 泡沫细胞 + 氨基胍（RAW264.7+oxLDL+NO 抑制剂，阴性对照组）：先将 RAW264.7 细胞与 oxLDL 共同孵育形成泡沫细胞，再用氨基胍处理以抑制 NO 的产生，同时也对该组应用 NanoNOP 进行成像，以便比较有无 NO 抑制时泡沫细胞的 NO 活性。为严格验证本研究中泡沫细胞构建的成功性，我们在图中纳入了油红O染色结果，结果显示与对照组相比，经 oxLDL 处理的巨噬细胞内出现明显的脂质滴堆积。为评估 NanoNOP 在细胞环境中的响应性，我们进行了一系列光声和荧光成像实验。将 RAW264.7 细胞、泡沫细胞及阴性对照组分别与 NanoNOP 共同孵育，随后获取各组的光声和荧光像，并对所得图像进行定量分析，以评估不同细胞类型的信号强度差异。光声和荧光信号的定量分析结果证实了观察到的定性趋势，且我们发现不同细胞组的信号强度存在显著差异。作为基线对照的 RAW264.7 细胞光声信号最弱，这表明该细胞类型中的 NO 水平极低。相反，经氧化低密度脂蛋白（oxLDL）诱导形成的泡沫细胞光声信号最强，这可能是由于泡沫细胞对 NanoNOP 的摄取量更高，而 NanoNOP 的固有特性可能增强了光声响应。由经氨基胍处理以抑制 NO 产生的泡沫细胞组成的阴性对照组，其光声信号处于中等水平。这表明 NO 可能在光声响应中发挥作用，且对 NO 的抑制会使信号减弱但不会使其完全消失。总体而言，这些结果表明 NanoNOP 在泡沫细胞中具有高响应性，其光声和荧光信号均显著强于 RAW264.7 细胞。阴性对照组的响应处于中等水平，这进一步凸显了 NO 对 NanoNOP 成像能力的影响。
动脉粥样硬化小鼠体内一氧化氮水平的成像
在急性肺损伤（ALI）中，NO 具有双重作用。一方面，NO 参与肺血管张力的调节，其生成对维持充足的灌注和气体交换至关重要。然而，在急性肺损伤期间，过量的 NO 生成可能会加剧炎症损伤。肺内 NO 水平升高与氧化应激增强、炎性细胞因子释放增加以及肺泡损伤相关。这些效应会加重 ALI 的严重程度，导致肺毛细血管通透性增加和随后的水肿形成。此外，过量的 NO 生成还可能促进活性氮物种（RNS）的产生，进一步加剧组织损伤和炎症反应。在本研究中，我们使用动脉粥样硬化小鼠模型（ApoE⁻/⁻小鼠）和通过脂多糖（LPS）给药诱导的急性肺损伤模型，考察了 NO 在这两种疾病中的作用。为建立动脉粥样硬化状态，我们首先给 ApoE⁻/⁻小鼠喂食高脂饮食（HFD），成功诱导出动脉粥样硬化小鼠。在动脉粥样硬化诱导之后，我们通过给动脉粥样硬化小鼠鼻内施用脂多糖（LPS），建立了动脉粥样硬化（AS）与急性肺损伤（ALI）合并的实验模型。LPS 注射已被广泛用作诱导 ALI 的标准方法，是触发肺部炎症反应的可靠手段。为研究动脉粥样硬化（AS）小鼠急性肺损伤（ALI）期间的 NO 活性，我们在注射 NanoNOP 后的不同时间点收集了两组小鼠主动脉区域的光声信号。通过对光声信号进行定量分析，以监测主动脉内 NO 活性的动态变化。注射后 0.5 小时，AS 组和 AS+ALI 组之间的光声信号没有显著差异。然而，在注射后 1 小时，AS+ALI 组的光声信号较 AS 组显著增加。这表明在 AS 小鼠中诱导急性肺损伤会增强 NO 活性，这可能是由于 LPS 处理引发的炎症反应所致。注射后 2 小时，两组的光声信号均有所增强，反映出 NO 活性随时间的整体增加。尽管如此，AS+ALI 组仍比 AS 组表现出更明显且显著更强的光声信号。这进一步表明，动脉粥样硬化与急性肺损伤合并会促进 NO 生成增加，这可能是由于该组中炎症级联反应和内皮功能障碍的加剧所致。
结论
我们研发了一种一氧化氮（NO）响应探针 NOP 及其纳米制剂 NanoNOP，用于 NO 的检测与成像。NanoNOP 通过将 NOP 包裹在两亲性聚合物 mPEG-DSPE 中合成，形成的纳米颗粒平均尺寸为 30 纳米。该探针在生理条件下表现出优异的稳定性，并且对 NO 具有显著的敏感性和选择性，这体现在其光学特性会发生明显变化，包括接触 NO 后荧光和光声信号增强。在细胞研究中，NanoNOP 对动脉粥样硬化中的关键细胞类型 —— 泡沫细胞中的 NO 表现出高响应性。光声和荧光成像均显示，泡沫细胞中的信号显著强于对照巨噬细胞，且信号强度与 NO 水平相关。体内研究进一步验证了 NanoNOP 在检测动脉粥样硬化和急性肺损伤（ALI）模型中 NO 的实用性。在患有动脉粥样硬化合并急性肺损伤的小鼠中，NanoNOP 检测到主动脉区域的 NO 水平升高，其光声信号显著高于单纯动脉粥样硬化小鼠。
参考文献
Development and Validation of a Nitric Oxide-Responsive Optical Probe for Cardiovascular Disease with Acute Lung Injury In Vivo Imaging,Si-Yan Yu,Jing-Jing Qiao, Chun-Pu Mao, Shuai Ying,* Li-Hong Zhu,* and KaiWang*，Anal. Chem. 2025, 97, 11328−11336，https://doi.org/10.1021/acs.analchem.5c01709
