本文提出可逆的结合探针，其能够选择性地检测NTR的还原形式（red-NTR），并产生荧光开启响应。该探针是一种带有硝基苯基吡啶基团的苯并香豆素染料，通过硝基与还原的辅因子黄素单核苷酸（FMNH2）之间的氢键来稳定探针。这种相互作用抑制了酶还原和光诱导电子转移引起的荧光猝灭。该探针选择性地将红色NTR与其氧化形式（ox-NTR）区分出来，从而可以观察缺氧细胞、小鼠肿瘤组织和经历过早衰老的细胞中的活性酶水平。
评估rNTRp 对NRT的传感性能
当rNTRp用red-NTR（商用oxNTR和NADH的混合物）处理时，没有观察到预期的PyBC 1 (≈590 nm)的发射峰，尽管在655 nm处出现了最大的开启型荧光响应。结果表明，探针保持未反应，但与酶结合。此外，当在没有NADH的情况下用oxNTR处理rNTRp时，没有信号改变。与red-NTR相比，没有吸收光谱移位。结果表明，rNTRp只识别red-NTR，而不识别ox-NTR。rNTRp和red-NTR之间的相互作用似乎是由非共价结合驱动的。本文研究了具有最小结构扰动的rNTRP的其他几种同系物，制备BC1—B15，其在给电子氨基和连接至吡啶钥核的苄基两者中具有结构差异。BC 1和BC 2 带有甲胺和丙醇胺供体，而不带有烯丙基胺，它们在red-NTR存在下也表现出信号增强。然而，带有二甲胺供体的BC 3没有表现出相当大的信号变化。结果表明，能够作为氢键供体的胺供体是酶结合所必需。在BC 4和BC 5中，分别用苄基和（对羧基）苄基代替（对硝基）苄基来进行测试，发现没有产生任何信号变化。因此，硝基和仲氨基似乎都是酶结合所必需的。
溶液中NTR探测
在不同浓度的NADH（1.0 - 500 μm）条件下，将5.0 μm rNTRP与2.0 μg mL−1 NTR进行反应。在固定浓度fox-NTR（2.0 μg mL−1）下，rNTRp（5.0 μm）在100 μm NADH条件下表现最佳。然后，在100 μm NADH存在下，将rNTRP置于不同浓度的NTR（0.08-8.0 μg mL−1）中，并监测所得荧光。信号在4.0 μg mL−1 NTR处饱和。因此，将优化的条件（100 μm NADH、4.0 μg mL−1 NTR和5.0 μm rNTRP）用于实验测定。当用4.0 μg mL−1 red-NTR处理5.0 μm rNTRP时，30 min后达到信号饱和。荧光偏振实验表明，当探针用浓度增加的fox-NTR处理时，偏振值没有变化。该结果再次说明探针不与ox-NTR相互作用。rNTRp的计算检测限（LOD）为25 ng mL−1，与其他基于反应的NTR探针报告的值相当。在pH = 7.4的缓冲液中，在25 °C下使用Benesi-Hildebrand方程测定的结合常数为14.1 × 106 m−1，这表明rNTRP与red-NTR的结合位点具有很强的亲和力。通过抑制剂测定证实rNTR β与red-NTR活性位点的结合。加入双香豆素（一种与NTR活性位点结合的分子），荧光强度迅速下降。已知，双香豆素还抑制NADH依赖性电子转移途径。这是将非活性ox-NTR转化为活性形式red-NTR的必需途径。
rNTRP对各种生物学相关酶的荧光响应
将5.0 μm rNTRP分别与牛血清白蛋白（BSA）、人血清白蛋白（HSA）、半乳糖苷酶、甘露糖苷酶、丙酮酸激酶、羧肽酶、醌氧化还原酶（HNQO 1）、半胱氨酸蛋白酶、猪肝酯酶（PLE）和oxNTR（各5.0 μg mL−1）在pH= 7.4 PBS中测试，均未观察显著荧光信号变化。通过SDS-PAGE进一步证实rNTRP对red-NTR超过ox-NTR的特殊选择性。将rNTRP（50 μm）与ox-NTR或red-NTR（200 μg mL−1）反应1 h，进行SDS-PAGE。red-NTR有较强的荧光发射带，而氧化NTR无荧光发射，表明rNTRP可用于red-NTR的选择性标记。
rNTRp对NRT的实时监控
研究氧化剂1,4-苯醌（BQ）的影响，通过氧化FMNH2将red-NTR转化为ox-NTR。在这些条件下对两种探针进行了测试，参考探针为NY。连续加入BQ后，观察到rNTRp的荧光逐渐下降，这与上述它对red-NTR的选择性优于ox-NTR的选择性的理论相一致。这种随时间变化的荧光猝灭反映了red-NTR水平的实时变化。随后加入NADH，部分恢复荧光信号，因为NADH将ox-NTR中的FMN还原为FMNH2，重新生成有活性的red-NTR。相比之下，添加BQ或NADH后，NY的荧光信号基本保持不变，因为基于反应的探针一旦被酶激活，就不再能够反映NTR水平的动态变化。
探针在生物系统成像中的适用性
利用rNTR在水性介质中基本不发光，在非极性有机溶液中发光强度大的特性，在A549细胞中，rNTRp的最大发射波长为655 nm，这表明溶液与细胞环境之间rNTRp的光学性质没有显著差异。即使在365 nm连续紫外线照射10 min下，探针也表现出很高的光稳定性。A549细胞与Mito-green和rNTRp共孵育1 h，然后进行荧光成像。Pearson相关系数（PCC）为0.88，感兴趣区域（ROI）强度曲线完全重叠，表明rNTRp定位于线粒体。rNTRp在细胞核周围的线粒体中产生明亮的荧光。相比之下，BC 3（含有N,N-二甲胺供体的rNTRp的同源物）在细胞环境中表现出可忽略的荧光，表明缺乏与red-NTR的结合。我们使用rNTRp比较癌细胞（A549、HeLa、HT 29、MCF 7和PC 3）和正常细胞（HEK293、MEF和PNT2）之间的实时细胞red-NTR水平。癌细胞的荧光强度高于正常细胞，表明癌细胞具有较高的NTR水平，酶活性也更强。研究缺氧对red-NTR水平的影响。用5.0 μm rNTRp处理正常HEK 293、MEF和PNT 2细胞，并使其处于缺氧条件下。PNT 2和mef细胞的荧光强度显著增加，而HEK 293细胞的荧光强度几乎没有变化。这些结果表明，缺氧可导致MEF和PNT 2细胞中red-NTR水平升高。推断，缺氧可以提高red-NTR水平，同时降低ox-NTR水平，从而维持NTR总浓度不变。在HEK 293细胞中观察到的耐缺氧行为表明，这些细胞中缺乏NTR或NTR水平显著降低。
低氧时red-NTR的水平约为常氧条件下的两倍。与传统的探针相比，本文探针优势在与酶的结合保留特性。将NY作为对照，进行了研究，将A549细胞与rNTRp (5.0 μm)和NY (100 μm)共培育6 h(需要长时间、高浓度培育，才能观察到信号)。在常氧条件下(以反应探针为例)，将培养基更换为pH= 7.4、含10% MeOH的PBS。为了避免信号串扰，分别在550-575 nm和650-700 nm窗口收集NY和rNTRp的细胞发射强度。NY的信号逐渐减弱，而rNTRp的信号几乎保持不变。因此，与已知的NTR探针不同，酶结合的rNTRp能够抵抗洗脱。大多数靶向线粒体的NTR探针计算亲脂性cLogP = 9-13，rNTRp的cLogP较低，为1.8。对于结构相关的分子，其分子量和cLogP值成比例相关。高cLogP值可能表现出不良的特征，如水溶性低，肾脏排泄缓慢，与膜和蛋白质的非特异性结合高。因此，rNTRp在此方面具有优势。
探测衰老细胞中的red-NTR
利用rNTRp独特的传感特性，我们研究了化学诱导的早衰对red-NTR水平的影响。研究了几种以不同方式引起衰老的化学物质，如帕博西尼（抑制细胞周期蛋白依赖性激酶）、顺铂（交联DNA）、5-溴脱氧尿嘧啶（5-BrdU;诱导复制压力）、喜树碱（抑制拓扑异构酶）、吲哚-3-甲醇（抑制端粒酶）和佛波酚12-肉豆蔻酸-13-乙酸酯（PMA;激活蛋白激酶C）。将A549细胞分别用这些化学物质处理给定的时间。通过追踪衰老相关β-半乳糖苷酶（SA-βgal）来确定细胞衰老的诱导情况。使用O-硝基苯基-β-D-半乳糖苷 (ONPG）检测。接下来，对这些细胞进行rNTRp染色，并进行CLSM成像，健康细胞有强烈的荧光，而衰老细胞的荧光相对较弱。特别是喜树碱和吲哚-3-甲醇的效果尤为显著。结果表明，衰老影响氧化态NTR和还原态NTR之间的平衡。综上所述，衰老细胞中的NTR活性受到抑制。
结论
本文报道了首个分子探针rNTRp的开发，其可以与硝基还原酶的活性还原形式red-NTR可逆地相互作用。常规探针会发生不可逆的酶促还原反应，而该探针通过其硝基和酶的还原辅因子FMNH2之间的氢键可逆地与底物结合。这种相互作用降低了硝基部分的还原电位，从而抵抗酶促还原。这种作用还增加了LUMO+1能级，抑制了光诱导电子转移猝灭。即使该探针本身荧光较弱，但在细胞中与red-NTR结合时会发出强烈的红色荧光。与仅提供酶活性静态累积数据的反应型探针不同，rNTRp能够实时监测red-NTR水平。此外，反应型探针产生的还原产物会迅速扩散到细胞外，降低数据的可靠性，但与酶结合rNTRp仍然保持在细胞内，测量准确性更高。
参考文献
Real-Time Detectionof Reduced Nitroreductase with a Reversible Fluorescent Probe, SouravSarkar,*AnushreeShil, YongWoongJun, YunJaeYang, RanranCheng, WenliWu, XuechenLi, QiongzhengHu,*andKyoHanAhn*, Adv.Sci.2025,e08689. https://doi.org/10.1002/advs.202508689.
