内容提要
本研究筛选了一种近红外荧光（NIRF）探针DCICl-H2Sn，用于检测细胞和小鼠模型中的H2Sn，该探针采用二氰基异佛尔酮（DCN）为骨架，邻位NO2取代的苯磺酸基团，DCICl-H2Sn与H2Sn反应后，在675 nm处发出荧光“开启”信号。得益于其优异的光学性质，DCICl-H2Sn可同时监测肝细胞内外源性和内源性H2Sn水平的变化，利用DCICl-H2Sn，我们探讨了H2Sn在APAP或CCl4诱导的急性肝损伤（ALI）小鼠模型中的作用。结果显示，H2Sn水平与肝损伤的严重程度呈负相关，提示H2Sn可作为评估ALI严重程度的潜在生物标志物。
结果和讨论
分子设计：以DCI染料为分子骨架，设计了具有苯磺酸基的特异性识别基团，通过调节磺酸基苯环上取代基的位置和吸电子能力，磺酸基对亲核物种的反应性可以有效地调节。基于这种策略，六个DCI衍生的。合成了苯磺酸盐化合物，包括三个-CF3取代的衍生物和三个-NO2取代的衍生物。评估了它们对常见活性硫物种（Cys、GSH、NaSH和Na2S4）的荧光响应。无论-CF3取代基是在苯环的邻位、Meta位还是帕拉引入，探针对Cys、GSH、NaSH和Na2S4表现出可忽略的荧光响应。在Meta位和帕拉具有较强吸电子-NO2基团的探针（DCICl-m-NO2和DCICl-p-NO2）对Cys或GSH表现出弱的特异性荧光响应。-NO2基团位于邻位的DCICl-H2Sn对H2Sn表现出高选择性，使其能够应用于H2Sn的生物成像。这些化合物之间反应性的显著差异可以归因于-NO2的双重共振和诱导效应，而不是−CF3的单独诱导效应。
DCICl-H2Sn对H2Sn的光学性质：首先，在PBS溶液中研究DCICl-H2Sn（10 μM）的吸收和荧光光谱,该探针的最大吸收峰位于约384 nm处。令人惊讶的是，加入Na2S4后，在535 nm处出现了新的吸收带。在不存在Na2S4的情况下，DCICl-H2Sn体系几乎不产生荧光信号，但随着Na2S4浓度的增加，DCICl-H2Sn在675 nm处有明显的荧光“开启”响应，且荧光发射峰强度逐渐增强。在0 - 70 μM范围内，675 nm处的荧光强度与Na2S4浓度显示出良好的线性关系。据标准3σ/k方法测得DCICl-H2Sn对Na2S4的检出限（LOD）为0.284 μM。此外，结果表明：在无Na2S4存在下，DCICl-H2Sn体系的荧光信号在40 min内保持不变，加入Na2S4后，荧光信号随时间逐渐增强，在30 min达到一个稳定平台，并在随后的10 min内保持稳定。还考察了pH值对DCICl-H2Sn性能的影响。在2.0 - 10.0的pH范围内，不存在Na2S4时，DCICl-H2Sn在675 nm处的荧光强度不受影响。
监测活细胞中的H2Sn动力学：在验证了DCICl-H2Sn作为荧光探针检测H2Sn的可行性后，进一步评价了其对活细胞中外源性和内源性H2Sn的成像潜力，并采用CCK-8法检测了不同浓度DCICl-H2Sn对HepG 2细胞的细胞毒性，结果表明，50 μM DCICl-H2Sn孵育24 h后，仍有80%以上的细胞存活，随后，采用共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）对活细胞中的外源H2Sn进行成像。将细胞分别与Na2S、HOCl和Na2S + HOCl孵育，然后用DCICl-H2Sn染色。细胞,单独用Na2S或HOCl处理的细胞显示弱的荧光信号，而Na2S + HOCl处理的细胞的荧光强度由于Na2S与HOCl的氧化还原反应在细胞内产生H2Sn而显著增强。与对照组相比，Na2S4预处理的细胞显示出较强的荧光信号，而H2Sn清除剂ZnCl2处理的细胞显示出较强的荧光强度，说明DCICl-H2Sn可以穿透细胞膜，检测细胞内的H2Sn。
为了验证DCICl-H2Sn示踪内源性H2Sn的可行性，用脂多糖（LPS）刺激HepG 2细胞，在LPS预处理10或20小时后，将细胞与DCICl-H2Sn孵育30分钟，为了证实增强的荧光信号来源于LPS诱导的内源性性H2Sn产生，选择用ZnCl2处理细胞，观察到荧光信号的显著衰减。这表明DCICl-H2Sn能够使活细胞中产生的内源性性H2Sn成像。
体内APAP或CCl4诱导的肝损伤成像：内源性H2Sn通过调节肝脏中硫化物代谢水平在肝损伤的发生和发展中起着至关重要的作用。在进行体内成像实验之前，首先评估了DCICl-H2Sn的生物安全性。PBS和DCICl-H2Sn处理的小鼠之间的H&E染色结果的比较显示，在心脏、肝脏、脾脏、肺或肾脏中没有显著的形态学差异，表明DCICl-H2Sn是无毒的和生物相容的。通过腹腔注射对乙酰氨基酚（APAP）和四氯化碳（CCl4）建立两种经典的ALI小鼠模型，对照小鼠腹部肝脏部位的荧光信号显著高于APAP或CCl4处理组的荧光信号。与APAP或CCl4处理组相比，灌胃给予水飞蓟宾（SLB）的小鼠表现出明显增加的荧光信号，主要器官的离体荧光成像证实了荧光信号主要位于肝脏中，APAP或CCl_4处理组的肝脏中的荧光强度明显高于APAP或CCl4处理组。治疗组小鼠的肝脏荧光显著低于对照组，而SLB治疗逆转了APAP或CCl4诱导的肝脏荧光降低, H&E染色进一步揭示了来自对照小鼠的肝组织表现出明确的结构，没有肝细胞肿胀或炎性浸润的迹象。来自APAP或CCl4处理的小鼠的肝组织在肝小叶中表现出严重的炎性细胞浸润，肝细胞排列紊乱，以及存在变性、坏死和再生的肝细胞，沿着有不对齐或缺失的中心静脉。用SLB处理的小鼠显示出与对照组相似的肝脏结构，具有减少的炎性浸润和组织坏死区域。另外，使用ELISA分析丙氨酸氨基转移酶（AST）和丙氨酸氨基转移酶（ALT）的血清水平。结果表明：（1）在急性肺损伤小鼠模型中，H2Sn与APAP或CCl4水平呈负相关，提示H2Sn可作为评估APAP或CCl4所致急性肺损伤严重程度的潜在生物标志物;（2）SLB对APAP或CCl4诱导的ALI具有保护作用。
总结
我们筛选了一种能够高灵敏度、高选择性检测H2Sn的近红外荧光探针DCICl-H2Sn，实现了对细胞和小鼠模型中H2Sn水平动态变化的实时监测，结果显示H2Sn水平与APAP或CCl4诱导的ALI严重程度呈显著负相关。总的来说，DCICl-H2Sn是用于研究H2Sn相关生物过程和评估肝病治疗剂的有前景的工具。
参考文献
Molecular Optimization of a Near-Infrared Fluorogenic Probe for Hydrogen Polysulfide Imaging in Acute Liver Injury，Zheng Wen,Wei Peng,Yongzhi Qi,Wenjia Zhang,* Ruirui Zhai, Xuejun Zhou, Heng Liu,*and Fabiao Yu*，Anal. Chem. 2025, 97, 14265，https://doi.org/10.1021/acs.analchem.5c00931.
