内容提要
本研究将dL-SiR-NO作为一种有效的溶酶体靶向近红外荧光探针，通过将溶酶体靶向单元吗啉与脱氧螺内酰胺-硅基罗丹明荧光团结合，其进一步与作为NO识别部分的二氨基苯缀合。dL-SiR-NO在酸性微环境中显示出更高的灵敏度，沿着具有良好的传感选择性。利用这种近红外荧光探针，我们对活细胞内NO水平的变化进行了成像，发现神经炎性疾病小鼠脑内NO浓度显著升高。
结果和讨论
dL-SiR-NO的设计与合成
dL-SiR-NO的合成选择硅罗丹明作为荧光团是因为其具有优异的光稳定性、较远的发光波长和良好的生物相容性。在酸性条件下，NO与荧光反应后，其共轭结构发生改变，从而激活荧光，为了增强其在溶酶体中的定位，我们通过硅罗丹明与1-将（4-吗啉代）-2-丙炔·邻苯二胺掺入探针的螺环中以获得螺内酰胺-硅罗丹明结构。通过对螺内酯中羰基的还原，减少半胱氨酸（Cys）和抗坏血酸/脱氢抗坏血酸/甲基乙二醛（AA/ DHA/MGO）等物质的干扰，最终得到了溶酶体靶向的NO荧光分子探针。
dL-SiR-NO对NO的体外响应
与NO反应后，脱氧螺-内酰胺-邻苯二胺转化为N-烷基苯并三唑，导致dL-SiR-NO的螺环结构打开并释放出硅罗丹明荧光团。因此，反应前后的颜色变化直观地证明了探针dL-SiR-NO对NO的识别能力。我们评估了dLSiR-NO在不同pH条件下对NO的响应。结果清楚地表明，dLSiR-NO仅在pH < 6.0时对NO表现出显著的响应，这表明该探针在溶酶体中选择性地感应NO，从而将潜在的干扰降至最低。此外，在不存在NO的情况下，pH的变化对探针的荧光强度几乎没有影响。与dL-SiR-NO的背景荧光相比，在pH 5.0下与NO反应后，探针的荧光增强。在pH5.0和7.4条件下，该探针对NO的响应时间分别为28和30 s，表明该探针在类似溶酶体的酸性环境中对NO具有较高的选择性。研究了dL-SiR-NO对活性氧、活性氮、活性硫等生物活性物质的荧光响应（·OH，H2O2，HClO，1O2，O2·−，ONOO−，NO2 −，H2S，HSO32−，SO3 2−，Cys，GSH）金属离子（Na+、K+、Cu2+、Ca2+、Mg2+）和抗坏血酸（AA）/脱氢抗坏血酸（DHA）/甲基乙二醛（MGO）。为了保持单一变量并防止与氢离子反应的干扰，反应在pH 7.4下进行。加入各种干扰物质，包括Cys/GSH和AA/DHA/ MGO，没有显著改变dL-SiR-NO的荧光强度。相反，加入NO显著增强荧光强度，因此，dL-SiRNO具有在复杂体系中选择性响应NO的潜力，有望应用于生物样品的NO传感和分析。由于溶酶体含有多种酸性水解酶，其在pH 5.0和pH 5.5之间最具活性，39我们进一步测试了dL-SiR-NO在pH 5.0下对NO的荧光响应。dL-SiR-NO的荧光强度随着NO浓度的增加而增加，证明了对0至100 μM范围内的NO浓度的线性响应，使用方程，检测限为42 nM这些结果表明，探针dL-SiR-NO适合于在酸性条件下对溶酶体中的NO进行成像。
体外和体内成像
在HeLa细胞中评价探针dL-SiR-NO的光稳定性。在用半导体激光器以恒定激光功率连续照射300 s后，dL-SiR-NO表现出良好的光稳定性。照射后，dL-SiR-NO的荧光强度保持在初始值的88.6%，具有良好的光稳定性。为了研究dL-SiRNO在亚细胞结构内的溶酶体靶向特性，在HeLa细胞中进行共定位成像分析，dL-SiR-NO和Lyso-Tracker绿色的荧光图像之间存在显著重叠，并且强度散点图显示出高度相关性，Pearson共定位系数R = 0.96。为了进一步验证dL-SiR-NO的溶酶体靶向特异性，我们与其他亚细胞器进行了系统的共定位研究,PC 12细胞用dL-SiR-NO沿着与市售细胞器标记物共染色：BDP 493/503用于脂滴，定量共定位分析显示，Pearson相关系数为0.67共定位效率的这种对比为dL-SiR-NO的良好溶酶体选择性提供了证据，证实了其在其他细胞区室中的最小脱靶积累。dL-SiR-NO可以有效地定位于活细胞的溶酶体。然后，我们使用已知在脂多糖（LPS）刺激时表达一氧化氮合酶（NOS）的RAW 264.7细胞，研究了dL-SiR-NO在细胞环境中可视化内源性一氧化氮（NO）的功效。将RAW264.7细胞分为3组，第1组仅用dL-SiR-NO（4 μM）探针孵育，产生微弱的红色荧光，第2组用脂多糖（LPS）刺激，第3组用LPS刺激，第4组用LPS刺激，第5组用LPS刺激，第6组用LPS刺激，第7组用LPS刺激，第8组用LPS刺激，第10组用在与dL-SiR-NO孵育之前，在20 μg/mL的浓度下，细胞内荧光强度显著增加。LPS刺激产生的内源性NO被dL-SiR-NO捕获。第三组用L-NNA预处理结果表明，dL-SiR-NO能有效地使内源性NO在活细胞中成像，并能有效地抑制内源性NO的合成，从而使细胞内的NO荧光强度明显降低。在加入LPS后，组ii表现出轻微但显著的荧光增强，而组iii中的荧光强度在LNNA处理后显著降低。我们测试了dL-SiR-NO对来自NO供体NOC-18的外源NO的响应。随着外源NO浓度的增加，dL-SiR-NO的红色荧光逐渐增加，表明dL-SiR-NO具有良好的膜渗透性和响应性。图3e中的定量数据表明，随着NO供体NOC-18浓度的增加，细胞内荧光强度显著增强。我们还使用PC 12细胞进行了实验。该探针对内源性和外源性NO均表现出优异的传感性能。我们还评估了在各种生物相关物质（包括NO、ONOO−、HClO、H2S、H2O2、Cu2+和Mg2+）刺激下PC 12细胞中dL-SiR-NO的荧光响应。结果表明，该探针对NO具有良好的选择性，在细胞水平上具有较强的抗干扰能力。
小鼠脑组织中NO的检测
为了建立小鼠神经炎症模型，将C57 BL/6 J小鼠分为对照组、神经炎症组和治疗组，研究表明脂多糖（LPS）可诱导小鼠神经炎症，导致脑组织持续氧化应激，从而升高脑组织中一氧化氮（NO）浓度。神经炎组每天注射LPS（0.25mg/kg），治疗组前4d注射LPS，后3d注射NAC（0.50mg/kg）。颅内注射dL-SiR-NO（0.50 mg/kg），并使用小动物3D光学活体成像仪对小鼠脑进行荧光成像，分析650 - 750 nm波长范围内的荧光信号。通过测量三组小鼠脑中促炎细胞因子-白细胞介素-1 β（IL-1β）和肿瘤坏死因子-α（TNF-α）的水平，与对照组相比，LPS处理的小鼠中IL-1β和TNF-α的表达水平分别增加了3倍和16倍。在N-乙酰半胱氨酸（NAC）处理后，IL-1 β和TNF-α的表达水平降低，验证LPS处理后小鼠脑中神经炎症的发生，并证明NAC的治疗效果。随后，颅内注射dL-SiR-NO并进行荧光成像。与对照组相比，LPS组的荧光显著增强，并且这种增强。另外，分离的脑组织的图像还显示，LPS处理的小鼠的脑的荧光强度高于对照组和LPS-NAC处理组。
总结
我们设计并合成了一种基于硅罗丹明（SiR）荧光团的溶酶体靶向一氧化氮（NO）探针dL-SiR-NO。当与NO反应时，光诱导电子转移（PET）机制被猝灭，允许SiR的荧光恢复和近红外荧光激活。由于稳定的罗丹明-去甲内酰胺结构，该探针的选择性明显提高，不受Cys/GSH和DHA/AA/MGO的干扰，dL-SiRNO对酸性囊泡中NO的成像具有上级灵敏度（即，并成功地应用于细胞内源性和外源性NO的监测。NO具有良好的生物相容性，可用于LPS诱导的神经炎症小鼠和MK 801（+）诱导的精神分裂症小鼠脑内NO水平的测定。
参考文献
Lysosome-Targeted Si-rhodamine Derivative for NO Imaging in Mice Brain with Neurological Diseases，Kunyi Wang, Jiaying Zhou, Yujie Geng, Guoyang Zhang, Zixuan Zhang, Yulong Jin,* Xiaolei Liu,*and Zhuo Wang*，Anal. Chem. 2025, 97, 12728，https://doi.org/10.1021/acs.analchem.5c01448.
