内容提要
我们利用5-外环化策略，以产生具有“零”内在背景荧光的多种可激活的七甲川花青探针，用于高对比度生物成像。在pH超过5.0时，花青染料主要以非荧光闭环形式存在，不受环境极性和蛋白质相互作用的影响，从而减少假阳性荧光信号。在与各种生物标志物反应时，包括甲基乙二醛（MGO），羟基自由基（·OH）和三磷酸腺苷（ATP），它们能迅速转变成荧光开环结构，表现出显著的近红外荧光增强（高达184倍）。利用扩展了这一策略，首次开发了多种NIR-II ATP可激活的花青探针，不仅以高信号灵敏地监测炎性肠病（IBD）中的ATP水平，与背景值的比值为48/1，但它也精确地检测了粪便中的细胞外ATP。
结果和讨论
我们合成了六个Cy7.5荧光团，它们具有不同的内和外侧臂，可以通过酰胺基团的亲核攻击形成五元至七元环。有了这些花青染料，我们首先使用pH滴定法检测它们的pKa值，12、13、14、24和25的pKa值分别为7.4、8.2、8.0、8.7和9.9，表明它们对生理pH敏感，在生理条件下主要以开环形式存在。此外，对于上述Cy7.5染料，在中性pH下观察到强的NIR-II荧光（7.4）这些结果表明它们几乎不转化成具有低内在荧光的闭环形式。经历5-外消旋环化的花青染料23显示pKa值为4.2，并且在pH 5.0-13.0范围内可以保持非荧光沉默形式。当pH从13.0降低到2.2时，23的最大吸收波长从454 nm逐渐移至822 nm，并在940 nm处产生强烈的近红外荧光。其吸收（822 nm）和荧光（940 nm）强度分别增加了168倍和74倍。
在5-exo-side-armed环化策略的指导下，我们构建了三个具有不同反应基团的5-exo-side-armed花青探针29-31，以及三个作为对照的5-endo-side-armed花青探针26-28 26-28的pKa值为7.1、8.0和7.1，表明它们在生理环境中可以容易地转化为具有高固有NIR荧光的荧光开环结构。5-外-侧臂花青探针29-31在生理pH下仅以闭环形式存在，分别表现出2.5、2.4和2.7的较低pKa。29-31的环状结构对极性和蛋白质结合具有抗性，具有“零”内在NIR-II荧光在pH 2.2的缓冲液中，29-31显示出在822/940 nm处的峰吸收/发射和在0.33%和0.61%之间的良好NIR-II量子产率。
有了这些5-exo-side-armed花青探针29-31，我们接下来检查了它们检测不同生物标志物的能力。探针29能够选择性地检测MGO，其主要在糖酵解过程中产生，并且与各种人类疾病如肥胖、糖尿病和癌症密切。探针30可以灵敏地检测·OH，·OH是最突出的活性氧之一，与多种疾病有关，包括神经退行性疾病和类风湿性关节炎（RA）。探针31能够特异性检测ATP，ATP作为细胞内能量的“分子货币”，在生理稳态中起着至关重要的作用，在被MGO、·OH和ATP活化后，探针29、30和31分别表现出在820 nm处的吸收和在940 nm处的荧光强度增加17-/163倍、275-/109倍和9-/137倍。证明这种环化/开环策略对于开发具有低固有背景荧光的各种可活化的七甲川花菁探针是通用的。随着相应分析物的增加，它们的峰值吸收（820 nm）和荧光发射（940 nm）逐渐增加，显示MGO的检测限（LOD）值为15.3 μM，·OH为113 nM，ATP为13.3 μM。此外，它们可以快速响应相关分析物，并且反应在40秒内29达到其平台，1秒内30达到其平台，3分钟内31达到其平台。
我们进一步研究了29 - 31用于高对比度体内成像的能力。在0 - 100 µM浓度范围内，它们均表现出良好的生物相容性此外，它们都能够灵敏地检测活细胞中的外源性和内源性MGO、·OH和ATP，显示出强烈的NIRII荧光，并且它们的倾向靶向细胞器分别是线粒体、溶酶体/线粒体和线粒体。，我们分别建立了皮下HepG 2肿瘤模型、λ-角叉菜胶诱导的RA小鼠模型和对乙酰氨基酚（APAP）诱导的肝损伤小鼠模型。HepG 2荷瘤小鼠。一般来说，异常糖酵解途径中产生的MGO可以被癌细胞中的glycoproteinase I（GLO 1）解毒。姜黄素是GLO 1的抑制剂，可以增加MGO的细胞内水平。分别向左侧和右侧肿瘤注射PBS和姜黄素后，在注射后2 h给予探针29，在左侧和右侧肿瘤中都观察到强烈的NIR-II荧光信号，并持续至少1h右侧肿瘤由于较高水平的MGO而表现出更强的荧光强度，显示出28，使用探针30检测RA小鼠模型中的内源性·OH。/1的高信号背景（SBR）比。使用探针30检测RA小鼠模型中的内源性·OH。将λ-角叉菜胶注射到右膝关节中4小时后，注射探针30以监测正常和炎症膝关节中的·OH水平。与具有可忽略的荧光信号的左膝关节相比，炎症右膝关节显示出显著的NIRII荧光，具有13/1的高SBR。（i. v.）注射到肝损伤小鼠体内以监测肝脏中的ATP水平。与具有微弱荧光的正常小鼠相比，在APAP处理小鼠的肝脏中观察到强烈的NIRII荧光，显示出出色的38/1的SBR。如果同用N-乙酰半胱氨酸（NAC）处理小鼠，肝脏中的荧光信号。为了进一步检查生物分布，收获了它们的主要器官，并且只有肝脏显示出强烈的NIR-II荧光。
通过用富电子杂环改变吲哚啉鎓的结构单元，我们构建了三个非对称的七甲川菁探针（42-44）。42-44在PBS溶液中与BSA孵育24 h后未显示可检测到的近红外吸收或荧光发射这些结果证实了5-外切-单核苷酸环化策略可以显著增强各种七甲川花青探针对pH、极性和蛋白质结合的稳定性。42、43和44在820 nm、922 nm和730 nm处的吸光度分别增加了14倍、93倍和102倍。值得注意的是，在相同条件下，42在955 nm处的荧光增强，。42-44在975 nm和1020 nm处的NIR-Ⅱ量子产率分别为0.17%、0.20%和0.05。随着ATP浓度的增加，它们的最大吸收和发射逐渐增加，42，43为1.5 µM，44为2.0 µM。同时，加入ATP后，42-44的溶液的颜色从葡萄酒或黄色变为绿色，证实了闭环到开环的转化此外，42-44显示出对ATP的高选择性。它们还可以快速检测ATP，响应时间约为20 s。5-外消旋环化策略是设计具有低内在背景荧光和高灵敏度的多种可活化七甲川花菁探针的最有效方法之一。
总结
我们开发了一种5-exo-cyclohalogenization策略来创建具有低固有背景荧光的可激活的七甲川花菁探针。引入具有亲核酰胺衍生物的exo-side-arm破坏了经典花菁染料的供体-π-受体（D-π-A）特征，导致对生理pH、极性和蛋白质相互作用稳定的非荧光闭环形式。通过改变闭环部分，一系列对MGO具有高度敏感性和特异性的刺激响应性七甲川菁探针已经被构建。OH和ATP，实现显著的近红外荧光增强（109至163倍）。此外，我们扩展了这一策略，以创建NIR-II ATP激活的花青探针首次，表现出优异的荧光增强值得注意的是，我们还通过主客体化学制备了ATP和ROS双响应NIR-II探针57，它不仅可以灵敏地监测IBD小鼠模型中的ATP水平，而且可以准确地检测炎症粪便中的细胞外ATP。
参考文献
Access to Diverse Activatable Heptamethine Cyanine Probes with Low Intrinsic Fluorescence via 5-exo-trig Cyclization Strategy for High-Contrast Bioimaging In Vivo，Fapu Wu, Bingbing Zheng, Xinyu Qiu, Tao Hu, Yuexia Yang, Kairong Yang, Bijia Zhou,Qian Ma, Dai-Wen Pang,* and Hu Xiong*,Angew. Chem. Int. Ed. 2025, 64, e202423059，Doi.org/10.1002/anie.202423059.
