内容提要
本研究开发的亚铁离子（Fe (II)）选择性荧光探针可通过选择性氧化脂质过氧化所必需的 Fe (II)，从而发挥铁死亡抑制作用。这一发现为开发一类具有潜在治疗应用价值的新型铁死亡抑制剂开辟了道路。
Fe (II) 与 N - 氧化物反应后铁氧化还原状态的 X 射线吸收近边结构（XANES）光谱分析
探针中的 N - 氧化物部分在被亚铁离子（Fe (II)）还原时会发生脱氧反应。该反应必然涉及 Fe (II) 的氧化，推测其会被氧化为三价铁（Fe (III)）或高铁中间体。为了确定铁与基于 N - 氧化物的探针反应后的氧化态，我们进行了 X 射线吸收近边结构（XANES）光谱分析。由于 RhoNox-5具有优异的水溶性 —— 这对于达到 XANES 测量所需的毫摩尔浓度至关重要，因此我们选择其作为本研究的代表性探针。我们在两种实验条件下采集了 XANES 光谱：（1）以硫酸亚铁铵（FAS，4 mM）形式存在的 Fe (II)，溶于含 20%（v/v）二甲基甲酰胺（DMF）作为助溶剂的水溶液中；（2）在相同溶剂条件下，RhoNox-5（4 mM）与 FAS（4 mM）的反应混合物。对比分析显示，反应混合物的吸收边向更高能量方向发生了明显偏移。以氯化铁（FeCl₃）作为 Fe (III) 参考标准的 XANES 光谱为基准，数据表明 Fe (II) 在与 N - 氧化物部分反应后被氧化为 Fe (III)。
基于 N - 氧化物的荧光探针对erastin 诱导的铁死亡的抑制活性
为了证实基于 N - 氧化物的探针可通过选择性氧化并消耗 Fe (II)来提供一种新型的铁死亡治疗策略，我们首先评估了 SiRhoNox-1 在 HT1080 细胞中对 erastin 诱导的铁死亡的保护作用—— 这是因为 RhoNox-5 由于亲水性强而无法穿透细胞膜。在未干预的情况下，erastin 的半数抑制浓度（IC₅₀）为 3.2 μM。值得注意的是，SiRhoNox-1 在浓度低至 1 μM 时即表现出显著的细胞保护作用，在 10 μM 时可实现完全的细胞拯救。此外，与经典的铁螯合型铁死亡抑制剂去铁胺（DFO）相比，SiRhoNox-1 显示出更强的抑制效力。我们对之前用于活细胞成像研究的基于 N - 氧化物的荧光探针库进行了全面评估，包括 RhoNox-1、RhoNox-4、SiRhoNox-1、MtFluNox、LysoRhoNox、MemRhoNox 和 H-FluNox。对于MtFluNox 和 H-FluNox，我们使用了它们的乙酰化衍生物（Ac-MtFluNox 和 Ac-H-FluNox）以增强细胞渗透性。评估在标准化条件下进行，该条件可使 HT1080 细胞存活率降至 10% 以下。这些探针的保护效力表现出明显的结构依赖性差异。定量分析显示，测试探针之间的效力谱各不相同。RhoNox-1 和 Lyso-RhoNox 表现出显著的铁死亡抑制作用，IC₅₀值均为 12.8 μM，而 RhoNox-4 和 SiRhoNox-1 的效力更强，IC₅₀值约为 3.5 μM。值得注意的是，H-FluNox、MemRhoNox 和 MtFluNox 在所有测试浓度下均未显示出保护作用。有效的抑制剂具有共同的罗丹明骨架，并表现出特征性的亚细胞分布模式：RhoNox-1、RhoNox-4 和 SiRhoNox-1 主要在内质网（ER）和 / 或高尔基体中积累，而 Lyso-RhoNox 则特异性靶向溶酶体。这些细胞器特异性探针效力的增强，与之前观察到的 “铁死亡早期阶段脂质过氧化起始于 ER” 的结论一致。有趣的是，与线粒体靶向相关的研究结果相反 —— 在阿霉素诱导的心肌细胞铁死亡中，线粒体游离 Fe (II) 的积累被认为起着关键作用，而线粒体靶向探针 MtFluNox 在此处未显示出保护作用。这种差异表明，线粒体 Fe (II) 升高可能是阿霉素诱导的铁死亡所特有的，而非铁死亡的普遍特征。
这一细胞器特异性响应模式与我们之前的观察结果一致，即在 erastin 诱导的 HT1080 细胞铁死亡过程中，线粒体游离 Fe (II) 水平保持稳定。MemRhoNox 的无效性可归因于其膜锚定结构 —— 其 N - 氧化物结构域被限制在细胞外空间 ¹⁷，无法接触到驱动脂质过氧化的细胞内 Fe (II) 库。H-FluNox 未表现出保护作用，这与我们之前证实的 “游离血红素不直接参与 erastin 诱导的铁死亡执行过程” 的结论一致 。该结果进一步验证了我们对铁死亡机制的理解以及基于探针的干预策略的特异性。
对 RSL-3 诱导的铁死亡的抑制活性
为了确定基于 N - 氧化物的探针作为铁死亡抑制剂的更广泛适用性，我们评估了它们对 RSL-3 诱导的铁死亡的保护作用 ——RSL-3 通过抑制谷胱甘肽过氧化物酶 4（GPx4）发挥作用。实验条件与 erastin 研究保持一致（处理 12 小时），RSL-3 浓度（10 μM）是根据剂量反应研究确定的最大细胞死亡浓度。在 RSL-3 处理的 HT1080 细胞中，RhoNox-1、RhoNox-4 和 SiRhoNox-1 表现出强效抑制活性，细胞死亡减少超过 50%；Lyso-RhoNox 表现出中等程度的保护作用，在最高测试浓度（12.8 μM）时抑制率达到 30%。几项关键的对照实验验证了这些作用的特异性：（1）相应的不含 N - 氧化物部分的罗丹明和罗丹醇衍生物未显示出保护作用；（2）在抑制研究使用的浓度范围内，活性 N - 氧化物探针未表现出内在的细胞毒性。此外，我们还使用了 FIN56和 FINO2作为铁死亡诱导剂，它们分别作为间接 GPX4 降解剂和 Fe (II) 介导的自由基生成剂。有效的探针 RhoNox-1、RhoNox-4 和 SiRhoNox-1 表现出相当的抑制活性。这些探针对 erastin、RSL-3、FIN56 和 FINO2 诱导的铁死亡均表现出稳定的抑制活性，表明它们的抑制作用不依赖于特定的铁死亡通路，且覆盖了四种主要的铁死亡类型。此外，这些结果进一步证实了我们之前的结论：N - 氧化物部分和适当的亚细胞靶向性（特别是靶向 ER / 高尔基体或溶酶体）都是有效抑制铁死亡的关键结构要求。（铁死亡标志性特征相关研究：）N - 氧化物探针对 Fe (II) 依赖性脂质过氧化及胞内 Fe (II) 水平的影响
为了直接评估基于 N - 氧化物的探针对铁死亡标志性特征 ——Fe (II) 依赖性脂质过氧化的影响，我们采用了基于 C11-BODIPY 的荧光显微镜技术。由于 SiRhoNox-1 的远红光发射特性可避免与 C11-BODIPY 的光谱重叠，因此我们选择其用于这些研究。将 HT1080 细胞暴露于 erastin（10 μM）中，同时加入或不加入 SiRhoNox-1（5.0 μM）处理 6.0 小时，并以 DFO 作为基准抑制剂。荧光成像分析显示，SiRhoNox-1 可有效抑制 erastin 诱导的脂质过氧化增加，其抑制水平与 DFO 相当。在 RSL-3 诱导的铁死亡中也观察到了类似的抑制模式。随后，我们以 SiRhoNox-1 作为抑制剂，以 RhoNox-4 作为监测活细胞中游离 Fe (II) 的荧光探针，探究了 erastin 诱导的铁死亡过程中细胞内游离 Fe (II) 的水平变化。用 erastin（10 μM，6 小时）处理后，荧光强度增加，表明游离 Fe (II) 水平上调；而当 SiRhoNox-1 与 erastin 共同处理时，荧光强度保持不变。这些发现直接证明，SiRhoNox-1 通过选择性氧化消耗催化性 Fe (II) 库，从而抑制 Fe (II) 依赖性芬顿型自由基反应，进而阻止铁死亡。
基于 N - 氧化物的探针对铁死亡的选择性验证
为了确定基于 N - 氧化物的探针对铁死亡的特异性，我们评估了它们对其他细胞死亡方式的影响。在存在或不存在 RhoNox-4 或 SiRhoNox-1 的情况下，用已确定的坏死诱导剂（过氧化氢，5.0 mM，12 小时）或凋亡诱导剂（星形孢菌素，1.0 μM；或鱼藤酮，64 μM，24 小时）处理 HT1080 细胞。值得注意的是，两种探针均未对凋亡或坏死性细胞死亡表现出保护作用，这证实了它们对铁死亡通路的选择性抑制。
总结
我们已经建立了基于N-氧化物的探针可以通过选择性氧化和随后的Fe（II）耗尽来有效地抑制铁凋亡。这种机制代表了一种新的抑制铁凋亡的方法，不同于以前报道的策略。N-氧化物化学的多功能性表明了在各种叔胺化合物中更广泛应用的潜力。值得注意的是，FINO-2的存在，含有内过氧化物基序的铁凋亡诱导剂25（也用于其他Fe（II）选择性荧光探针）表明了一种有趣的可能性，即内过氧化物和氮氧化物基化合物可以作为补充工具，。我们对靶向细胞器的N-氧化物探针的系统评价揭示了定位于ER/高尔基体和溶酶体的化合物有效地抑制erastin和RSL-3诱导的铁凋亡。不同的铁凋亡诱导剂之间的这种一致的保护表明，Fe（II）催化的Fenton型反应发生在这些特定的细胞器中，作为铁凋亡级联中的常见下游事件。这一发现与以前的报告一致，确定ER是脂质过氧化的主要位点，并补充了早期使用细胞器靶向RTA 30和脂质过氧化物抑制剂的研究。我们的基于N-氧化物的探针的独特机制-直接干预Fe（II）依赖过程为研究铁中毒细胞死亡提供了强有力的工具。
参考文献
Inhibition of ferroptosis by N-oxide-based fluorescent probes via selective oxidation of ferrous ions†. Kanta Kawai, Rie Haruki, Shunsuke Nozawa, Hideko Nagasawa and Tasuku Hirayama, Chem. Sci., 2025, 16, 11240,https://doi.org/10.1039/d4sc07972h
