内容提要
本研究报道一种具有脂滴（Lipid drops，LD）特异性近红外发射PS（DPCMP）应用于诱导铁凋亡和细胞凋亡。由于其扭曲的分子构象而具有诱导发射特性，良好的生物相容性和适当的亲脂性使DPCMP能够特异性地染色活细胞中的LD。在白色光照射下，DPC MP通过I型和II型光化学反应显示出强大的活性氧（ROS）产生能力。DPCMP介导的光敏化产生的致命活性氧簇的大量积累引发脂质过氧化反应，损害细胞氧化还原稳态，并导致内质网氧化应激，最终在活癌细胞和多细胞肿瘤球体中通过同时发生的铁凋亡和凋亡抑制细胞增殖。
结果和讨论
分子设计、合成与光物理性质
通过将给电子基团（EDG）和吸电子基团（EWG）共价结合到π共轭的香豆素骨架上，构建了LD靶向的AIE PS，适当的推拉效应结合扩展的π共轭有效地促进了PS的发射波长红移，并显著地调节了其非线性光学性质，具有强的近红外（NIR）发射和良好的双光子吸收（2 PA）特性。适当的亲脂性有利于PS在LD中的精确定位。作为有效的分子转子，扭曲的二苯胺取代基使PS具有典型的AIE特征，吸电子能力的逐渐增强使PS的吸收光谱和发射光谱发生红移，促进了光诱导活性氧的产生。在465 ~ 485 nm的范围内，按照DPCMM ~ DPCMP的顺序，表现出向红色移动的吸收峰，在长波长范围内的强吸收能力可以归因于从二苯基氨基到二氰基部分的分子内电荷转移（ICT）跃迁。以DPCMP为例，在DMSO/水二元溶剂体系中，光激发后，PS的荧光强度可忽略，量子产率较低（ΦF <$0.3%），这种微弱的发光行为可以归因于溶解状态下的快速分子内旋转，其通过非辐射跃迁有效地耗散了激发态能量。当fw超过70%时，DMCMP的荧光增强，当fw为90%时荧光强度达到最大值，继续增加fw至99%时荧光强度略有下降，ΦF为3.8%。其他三种PS也实现了类似的发射增强。散射分析，产生的流体动力学半径分别为73.2 nm（DPC MM）、73.3 nm（DPC MB）、73.1 nm（DPC MC）和62.1 nm（DPC MP）此外，在吸收光谱中，在fw为99%时，观察到所有PS的平稳尾部，这进一步证实了纳米聚集体的形成。在fw为99%时，PS的寿命测量范围为1.43 - 3.13 ns，在溶解状态下，（1.10−1.14 ns）。更重要的是，固体状态下的荧光发射波长在590 ~ 628 nm之间，荧光强度在8.3%~ 11.2%之间，高于溶液状态下的荧光强度（0.2- 0.5%）。这些结果明确表明，所有PS都具有典型的AIE特征。使用2′，7 ′-二氯二氢荧光素二乙酸酯（DCFH-DA）作为商业ROS指示剂来研究光敏化ROS的产生。一旦用白色LED光照射DPCMAr，DCF的荧光显著增加（400-700 nm，25 mW cm-2）。特别是对于DPCMP，DCF的荧光强度在40s内达到稳定，产生425倍的发射增强。包括二氢罗丹明123（DHR 123，用于O2·−），羟苯基荧光素（HPF，用于羟乙基）和9，10-蒽二基-双亚甲基二丙二酸（ABDA，对于1O2）进一步用于阐明ROS的种类。在照射DPCMAr 180 s后，DHR 123的荧光强度比照射前增加了1000倍以上，相反，在单独的DHR 123组中观察到13倍的荧光增强。当采用HPF时，与辐照前相比，最大发射增强为113倍（DPCMP）。这些结果清楚地表明，DPCMAr具有显著的产生I型ROS的能力。当用ABDA代替HPF并在白色光下照射相应的DPCMAr时，ABDA的吸光度逐渐降低，表明II型光化学的存在。照射600 s后，ABDA在378 nm处的吸光度降低到DPCMP初始值的10%。然而，在仅ABDA组中，观察到可忽略的吸收变化。进一步的实验表明，DPCMP的1 O2量子产率高达0.94。考虑到整体光学性质，DMCMP表现出最佳的ROS生成能力。短寿命O2·−然后通过电子顺磁共振（EPR）实验验证了光敏化DPCMP的1O2物种，分别使用5，5-二甲基-1-吡咯啉-N-氧化物（DMPO，对于O2·−和1O2）和2，2，6，6-四甲基-4-哌啶酮盐酸盐（TEMP，对于1O2）作为自旋捕获剂。当用白色光照射含有DPCMP和TEMP的PBS溶液时，观察到强度为1：1：1的三线EPR信号，g值为2.0057，归因于TEMP-1O2加合物。将DPCMP和DMPO混合物在甲醇中照射，检测到g值为2.0054的六线EPR信号，这与DMPO-O2·−加合物的EPR谱相一致。检测到g值为2.0058的1强度强度，揭示了DMPO-OH加合物的存在。在不存在DPCMP或白色光照射的情况下，没有观察到EPR应答。结果表明，DPCMP倾向于同时产生I型和II型ROS。
LD靶向成像
利用激光共聚焦扫描显微镜（CLSM）系统研究了DPCMAr的细胞摄取和成像特性，结果发现，DPCMAr（10 μM）对HeLa细胞染色30 min后，细胞内的荧光呈离散分布，与商业BODIPY 493/503的共定位实验LDs探针检测结果表明，DPCMAr的荧光与BODIPY 493/503的绿色荧光完全重叠，特别是DPCMP，皮尔逊相关系数（PCC）可高达0.99。以DPCMP为例，通过引入其他亚细胞器探针，包括Mito-Tracker Deep Red（MTDR，线粒体探针）、ER-Tracker绿色（ERTG，ER探针）、DiD（质膜探针）、Hoechst 33342（核探针）、Golgi-Tracker绿色（GTG，高尔基体探针）、。和溶血追踪器深红（LTDR，溶酶体探针）。与LD探针的高PCC值相比，其他细胞器探针的PCC值较低，范围为0.04 - 0.15，证明了DPCMP的特异性LD靶向能力。更重要的是，将DMCMP的浓度降低至1 μM后，这有利于在复杂的生物场景中成像。
光动力疗法引起的铁凋亡
考虑到其精确的LD靶向能力和强大的光动力学功效，我们评估了DPCMP在活细胞中的光治疗活性， DCFH-DA和DPCMP共染色的HeLa细胞在用白色光照射后逐渐出现绿色荧光，这归因于DCF，延长照射时间导致荧光增强，并且荧光强度在45秒后达到饱和，与照射前相比具有约8倍的荧光增强。同时用DPCMP和白色光照射（120 s）处理的组呈现最高百分比的ROS阳性细胞（>99.5%），这与CLSM结果一致。通过LD特异性DPCMP产生大量光敏ROS可能破坏细胞氧化还原稳态并诱导ER氧化应激。基于这一假设，我们首先使用商品化的Ca 2+探针Fluo-4AM研究了细胞内Ca 2+的水平，因为ER Ca 2+信号传导与无数相互作用的细胞过程有关。在没有DPCMP处理或光照射的情况下观察到微弱的荧光信号。相反，经DPCMP预染的细胞在白色光照射下，胞浆内可见明亮的绿色荧光，后者的荧光增强是未照射对照组的4.17倍通过流式细胞术进行的进一步定量分析显示，几乎所有细胞都被Fluo-4 AM照射。（阳性人群百分比>93%），表明光敏化的DPCMP促进了ER腔中的Ca 2+内流并损害了Ca 2+稳态，在用白色光照射DPCMP预染色的HeLa细胞P介导的PDT引起的氧化脂质的积累破坏了细胞内氧化还原状态的平衡，损害了ER的稳态。30分钟后，与没有DPCMP处理或光的组相比，MDA含量增加，DPCM。
脂质过氧化和ER氧化应激激活各种PCD途径。为了研究DPC的LD靶向PDT诱导的特定PCD模式，引入了不同的细胞死亡抑制剂。照射DPC预染色的HeLa细胞后，观察到不同的细胞增殖特征。对于用ferrostatin-1处理的组（Fer-1，铁凋亡抑制剂）和拉氨酰胺（z-VAD-fatal，凋亡抑制剂），细胞增殖抑制减轻（z-VAD-fetamine为61.79 ± 5.23%，Fer-1为55.97 ± 1.79%）与未加抑制剂组相比，z-VAD-fetoxin与Fer-1联合后，细胞存活率提高到83.36 ± 2.74%。自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤（3-MA，28.94 ± 0.59%）或坏死抑制素-1（Nec 1，33.79 ± 1.38%）均能有效抑制细胞增殖，提示铁凋亡和细胞凋亡是DPCMP介导的PDT诱导细胞凋亡的主要途径。免疫球蛋白重链结合蛋白（BiP）和C/EBP同源蛋白（CHOP）是一种重要的内质网分子伴侣，在内质网应激下调节未折叠蛋白的反应，而后者是ER应激诱导细胞死亡的关键调节因子。BiP和CHOP的过表达导致ER应激。用白色光照射DPCMP预染色的HeLa细胞10 min并静置3 h可增加BiP的量。结果发现，在未处理组和光照射组，BiP和CHOP的表达均明显受到抑制。另外，经DPCMP预染色的HeLa细胞经光照射后，BiP和CHOP的表达均明显降低。谷胱甘肽过氧化物酶4（GPX 4）的表达受到抑制。GPX 4表达的这种趋势与GSH/GSH/GSH-Px的结果一致。考虑到GPX 4通过募集GSH/GSSG抗氧化系统在减少促铁信号中的关键作用，GPX 4的耗尽无疑表明了GSSG的存在。在DPCMP介导的光疗过程中，caspase-3和Bcl-2的表达水平也下降，而裂解的caspase-3和Bax的量增加。考虑到ER氧化应激在细胞凋亡中的作用，caspase-3和Bcl-2的消耗，以及裂解的caspase-3和Bax的富集，显示了凋亡途径。总的来说，提出了PDT与LD靶向DPCMP协同诱导铁凋亡和细胞凋亡的分子机制DPCMP中ROS的产生导致致死性过氧化脂质的积累并激活铁凋亡细胞死亡。ER蛋白稳态的恢复，导致凋亡性细胞死亡。即使将DPCMP的浓度增加到100 μM，细胞死亡在没有光照射的情况下也被消除（细胞活力为94.34 ± 2.62%），结果表明，DPCMP具有良好的生物相容性，将细胞从黑暗移动到白色光下观察到不同的细胞增殖行为，加入DPCMP（100 µM）后，细胞存活率下降至9.25 ± 2.08%。引入4-苯基丁酸（4-PBA），一种有效的ER应激抑制剂，减轻了光毒性的严重程度，使细胞存活率为45.26 ± 1.37%（100 µM的DPCMP）。ROS清除剂N-乙酰-L-半胱氨酸（NAC）和非酶抗氧化剂维生素E（VE）被用于消除细胞内ROS或抑制脂质过氧化的传播周期，存活率分别为20.52 ± 0.56%和27.49 ± 0.66%。使用流式细胞术定量证实DPCMP的PDT功效。用白色光照射DPCMP预染色的细胞并静置3 h后，获得高凋亡细胞群体。
总结
本研究成功开发了一系列具有LD特异性的AIE PS（DPCMAr），利用其强烈的ICT效应和扭曲的分子构象，使其不仅具有典型的AIE效应，发射范围从远红外延伸到近红外区，而且具有I型和II型ROS的联合产生能力，具有良好的生物相容性、适当的亲脂性、良好的光稳定性使DPCMP能够精确地在活细胞的LD和斑马鱼胚胎的卵黄脂质中积累。协同的I型和II型光疗能力使DPCMP能够引发细胞内脂质过氧化，导致ER氧化应激，并通过在活癌细胞和MCTS中引起同时的铁凋亡和凋亡来抑制癌细胞增殖。这项工作为细胞器的发育提供了新的见解，诱导铁凋亡和增强抗肿瘤功效的靶向PS。
参考文献
Lipid droplet-targeted NIR AIE photosensitizer evoking concurrent ferroptosis and apoptosis，Jia Jia， Zhedong Ma ，Jiabao Zhuang ，Lantian Huo ，Chunli Zhou，Nan Li，Na Zhao，Aggregate. 2024;5:e516.，https://doi.org/10.1002/agt2.516.
