内容提要
本文提出在近红外二区（NIR-II）发射的有机光敏剂中构建分子内电场，以调节局部电子密度，从而推动耐缺氧癌症的光热诊疗发展。通过引入分子阳离子化方法和电子编程策略，所得的阳离子半导体结构实现了电子分布重排，形成了分子内电场，并促进了电子转移路径，使静电势差放大了 50 倍，从而加速了以羟基自由基（・OH）为主导的 I 型光敏化过程。体外研究表明，这种定制的纳米材料可选择性地靶向线粒体，并在激光照射下引发线粒体介导的癌细胞凋亡。这种制备的纳米平台能够实现 NIR-II 荧光成像辅助的光疗，并在 4T1 荷瘤小鼠模型中展现出体内抗肿瘤功效。
实验结果与讨论
制备与表征
我们首先选择富电子的三苯胺（TPA）和缺电子的噻二唑并喹喔啉（TQ）分别作为供体和受体，通过 C-C 偶联反应构建了三种具有近红外吸收和近红外二区（NIR-II）发射特性的 D-A-D 型分子骨架（分别命名为 OTT、BTT 和 BTT+）。引入吡啶基团和阳离子化方法，进一步优化分子框架的电子分布和系间窜越过程。这些有机半导体分子展现出特征性的近红外光学吸收和 NIR-II 发射特性，这归因于其高度共轭的框架结构，增强了电子在大分子骨架上的离域作用。考虑到目标产物的疏水性，我们采用两亲性聚合物 DSPE-PEG5000，通过纳米共沉淀法对这三种定制分子进行非共价功能化修饰，使其具备水分散性和生物相容性。透射电子显微镜（TEM）成像和动态光散射（DLS）测试表明，BTT + 纳米颗粒分布均匀，平均流体动力学直径约为 65nm。该纳米平台适宜的纳米尺寸，因其增强的渗透和滞留（EPR）效应，有利于在肿瘤内积累。同样地，OTT 纳米颗粒和 BTT 纳米颗粒的纳米尺寸分布也较为均匀，流体动力学直径分别约为 55nm 和 60nm。此外，测定这三种纳米颗粒 OTT NPs、BTT NPs 和 BTT+ NPs 的 zeta 电位分别为 - 13.33mV、-7.56mV 和 - 1.13mV，这表明 BTT + 带有正电荷，能够中和聚乙二醇外壳的负电荷，具备靶向线粒体的潜力。我们进一步研究了这些定制纳米平台的光学性质。OTT、BTT 和 BTT + 的二甲基甲酰胺（DMF）溶液在 791nm、755nm、731nm 处有最大吸收信号，并在 NIR-II 区域发射荧光，荧光峰分别位于 1116nm、1082nm 和 1056nm。与 OTT 相比，引入吡啶基团和阳离子化效应后，BTT 和 BTT + 呈现出吸收/发射蓝移现象。亲电的甲基吡啶鎓基团会导致离域结构的电子重新分布，使 D-A-D 型结构转变为 A’-D-A-D-A’骨架，从而降低整个共轭骨架的分子内电荷转移（ICT）效应，产生蓝移现象。有趣的是，水溶液中的 BTT+ NPs 比 BTT NPs 具有更长的波长吸收，这与在 DMF 溶剂中观察到的光学吸收情况相反。BTT+ NPs 在水溶液中的红移吸收主要归因于其聚集态下强分子间静电相互作用的形成。
在 808nm 激光照射下，使用 1000nm 长通（LP）滤光片记录 NIR-II 荧光成像（FLI）检测结果。结果显示，OTT、BTT 和 BTT + 的荧光强度逐渐增强，且发射波长逐渐缩短。基于这些结果，我们认为长波长发射荧光团的激发态更易通过振动或旋转途径失活，从而导致较低的量子产率。此外，为了深入探究 BTT+ NPs 的聚集行为，我们收集了 BTT + 在不同水含量（(fw）的水 / 乙腈混合物中的吸收光谱变化。结果表明，随着(fw)的增加，BTT + 的吸收光谱呈现红移趋势。与 BTT 的乙腈溶液相比，水溶液中的 BTT+ NPs 吸收峰红移了 47nm，这表明 BTT+ NPs 具有形成 J 聚集体的潜力。此外，水溶液中的 BTT+ NPs 比在乙腈溶液中显示出更明亮的 NIR-II 荧光信号，并且 BTT + 的荧光亮度几乎随着((fw)的增加而呈下降趋势，这体现了 D-A-D 型发色团典型的 NIR-II 荧光行为。总之，定制的 BTT+ NPs 可作为一种高效的 NIR-II 荧光造影剂，用于精确的生物成像解读。
鉴于这些光热诊疗剂出色的近红外吸收特性，我们还记录了它们在水相中的光热行为。结果显示，经 808nm 激光照射后，这些纳米体系溶液的温度迅速升高，OTT、BTT 和 BTT+ NPs（100μM）的溶液温度分别从 25.0℃升高到 65.3℃、80.5℃和 85.7℃。此外，更高功率的激光照射有利于光热转换，这与常规报道一致。随后，我们记录了不同含量的 BTT+ NPs 的温度变化。结果显示，温度增量与纳米试剂的浓度呈正相关。此后，通过收集升温及自然冷却曲线，我们计算出 BTT+ NPs 的光热转换效率（PCE）为 33.68%，显著高于 OTT NPs（22%），与 BTT NPs（33.02%）相近。此外，通过收集五次 “加热 - 冷却” 循环曲线，进一步探究了 BTT+ NPs 的光热稳定性。稳定性评估表明，所有循环中的温度升降变化均可忽略不计，证明了制备的 BTT+ NPs 具有出色的光热稳定性。
光敏化效果评估
鉴于这些制备的纳米平台由于其大 π 共轭离域作用而展现出出色的光学性能，我们在 808nm 激光照射下进一步探究其光动力效应。通过 ROS 敏感探针、非荧光性的 DCFH 评估 OTT、BTT 和 BTT+ NPs 产生 ROS 的能力，DCFH 在 ROS 作用下可转化为具有荧光的 2',7'- 二氯荧光素（DCF）。通过测量 DCF 的荧光变化来确定 ROS 的释放量。结果显示，单独的 DCFH 以及经激光照射的 DCFH + OTT NPs 组均无法诱导 DCF 的荧光增强，这表明 OTT NPs 产生 ROS 的能力可忽略不计。此外，BTT NPs 在 808nm 激光照射后显示出较弱的 ROS 释放。有趣的是，BTT 经过阳离子化处理后，得到的 BTT+ NPs 能够显著诱导 DCF 发出强烈荧光，这表明阳离子化的 BTT+ NPs 具有强大的 ROS 生成能力。因此，BTT+ NPs 在光照下能够快速产生 ROS，而 OTT NPs 和 BTT NPs 几乎不产生或产生较弱的 ROS。
随后，分别使用特异性荧光探针 APF、DHR123 和 SOSG 系统地研究了 BTT+ NPs 产生・OH、O2的情况。我们观察到，经光照的 BTT+ NPs 能够增强 APF 的荧光发射，表明其具有出色的・OH 生成能力，而单独的 APF 组则无响应。此外，进一步的结果显示，BTT+ NPs 对 DHR123 和 SOSG 无响应，这表明其产生 •OH, O2•−, 和1O2的能力不明显。总之，制备的 BTT+ NPs 可作为一种以产生・OH 为主的 I 型光敏剂，用于进一步的肿瘤耐缺氧光动力治疗。
细胞实验
结合 BTT + 纳米颗粒（NPs）对肿瘤细胞出色的光疗活性，利用 CCK-8 实验检测了 BTT+ NPs 在正常细胞系和癌细胞系中的细胞毒性。实验结果表明，即使在纳米试剂浓度较高的情况下，BTT+ NPs 对 L929 和 4T1 细胞系几乎没有暗毒性，进一步显示了其优异的细胞相容性。在 808nm 激光（(1W/cm2）照射 5 分钟后，BTT+ NPs 对 4T1 细胞呈现出明显的细胞毒性，且细胞死亡率与 BTT+ NPs 浓度呈正相关。然后，我们利用商业 DCFH-DA 和 HPF 荧光探针，通过共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）研究了在缺氧（(2%O2)）和常氧（(21%O2）环境下细胞内 ROS 的产生情况，以评估细胞内总 ROS 和・OH 的水平。图像显示，在常氧和缺氧环境下，经 808nm 激光照射后，用 DCFH-DA 染色的细胞内均记录到高亮度的绿色荧光信号，这表明在细胞水平上其具有卓越的耐缺氧 ROS 生成能力。相比之下，单独用 PBS、单独用 BTT + 以及 PBS 加光照处理的 DCFH-DA 检测到的绿色信号可忽略不计。此外，通过收集 HPF 与・OH 反应产生的绿色荧光通道，可实现・OH 生成的动态可视化。如 CLSM 图像所示，在缺氧和常氧条件下，用 BTT+ NPs 处理并照射的 4T1 细胞中均显著记录到令人满意的绿色荧光，表明其具有强大的・OH 生成能力。同时，对照组未发出荧光信号。此外，流式细胞术对 ROS 生成的定量分析进一步表明，在常氧和缺氧环境下均有有效的 ROS 释放。随后，为了进一步可视化肿瘤细胞的杀伤效果，使用 Calcein AM/PI 细胞染色试剂盒进行活 / 死细胞共染色实验，其中死细胞被 PI 染色产生红色荧光通道，活细胞被 Calcein AM 染色产生绿色荧光信号。图像显示，在常氧条件下，BTT+ NPs 在光疗作用下可有效杀死癌细胞。此外，在缺氧环境中，BTT+ NPs 也表现出令人满意的细胞光毒性，细胞死亡率超过 90%。相比之下，对照组细胞活力出色，这表明这种定制的 BTT+ NPs 具有优异的生物相容性。此外，为了进一步评估光疗过程中的细胞凋亡情况，利用 Annexin V-FITC/PI 凋亡细胞检测试剂盒通过流式细胞术检测来可视化活 / 死细胞的不同阶段。结果显示，细胞毒性主要与细胞凋亡有关，证明 BTT+ NPs 在光照后可有效诱导肿瘤细胞凋亡。此外，在单独用 PBS、单独用 NPs 以及 PBS 加激光照射处理的对照组中，几乎所有 4T1 细胞均存活。所有这些结果表明，BTT+ NPs 可作为一种高效的光热诊疗剂用于光疗，同时对正常细胞无毒。
体内双模态成像与抗肿瘤疗效评估
受 BTT + 纳米颗粒（NPs）出色的体外光声（PA）和近红外二区荧光成像（NIR-II FLI）能力的启发，在 4T1 荷瘤小鼠中对 BTT+ NPs 的生物双模态成像进行评估，以确定光疗的最佳时间点。将 BTT+ NPs（100 μM，150 μL）静脉注射到 4T1 荷瘤小鼠体内，通过双模态 PAI 和 NIR-II FLI 动态监测其在肿瘤区域的迁移和积累情况。NIR-II 荧光图像显示，注射 BTT+ NPs 5 分钟后，可清晰检测到活体小鼠的全身血管。随后，肿瘤区域的 NIR-II 荧光信号逐渐增强，在注射后 24 小时达到荧光亮度峰值。成功的荧光成像表明 NPs 在肿瘤部位高效积累，这归因于增强渗透和滞留（EPR）效应的被动靶向能力以及细胞内线粒体定位的主动靶向能力。有趣的是，PAI 结果显示定制的 BTT+ NPs 具有相同的迁移趋势，肿瘤部位的 PA 信号逐渐增强，并在注射后 24 小时达到峰值。之后，NIR-II 荧光和 PAI 信号均逐渐减弱，这主要是由于动态生物条件下的代谢消除。为了更直观地观察 BTT+ NPs 在生物体内的迁移和积累行为，记录了定量的 NIR-II FLI/PAI 信号。结果表明 NIR-II FLI 和 PAI 的迁移曲线变化趋势相似。最后，通过收集分离的包括肿瘤和主要器官在内的组织的离体 NIR-II 荧光信号，进一步研究了 BTT+ NPs 的生物分布。结果表明，NPs 在脾脏、肝脏和肿瘤中积累较多，因为在这些组织中检测到较高的 NIR-II 荧光亮度。相比之下，在肺、心脏和肾脏中的积累较少，证明定制的 BTT + 纳米平台主要通过肝胆途径进行消除和代谢。因此，利用可靠的生物成像结果，选择注射后 24 小时作为后续光疗实验的时间点，以最大化治疗效果。
在皮下 4T1 肿瘤模型上进一步研究 BTT+ NPs 的治疗活性。将荷瘤小鼠的治疗随机分为四组：PBS 组、BTT+ NPs 组、PBS + 激光组和 BTT+ NPs + 激光组。借助 NIR-II 荧光 / PA 成像，BTT+ NPs 能够实现高分辨率的肿瘤组织成像和高效积累，在 24 小时达到峰值。因此，在 24 小时的最佳时间点进行近红外光照射诱导的针对恶性肿瘤的光热治疗（PTT）。结果，在 BTT+ NPs + 光照射治疗组中，肿瘤区域的温度迅速升高，在 10 分钟时达到 61.1°C。相比之下，注射生理盐水的对照组温度变化较为温和，范围从 36.7°C 到 41.2°C，这进一步表明操作使用的近红外光无法消除肿瘤组织。此外，记录了定量的温度变化曲线，结果显示 BTT+ NPs 触发的 PTT 具有良好的有效性。此后，监测所有治疗小鼠的体重，发现体重没有显著变化，这意味着 BTT+ NPs 对生物体具有良好的生物相容性。此外，通过监测治疗组的肿瘤生长情况来评估光疗的疗效。如图所示，照射后 BTT+ NPs 治疗组的肿瘤生长明显受到抑制，而其他对照组的肿瘤则迅速生长。然后，在第 14 天对所有治疗小鼠实施安乐死并收集肿瘤组织。显然，实验组的肿瘤尺寸小于对照组。BTT+ NPs 引发的高效肿瘤消除归因于这种定制纳米平台的光热效应和耐缺氧 ROS 生成能力。
结论
我们提出了一种电子优化策略，即通过在具有线粒体靶向能力的近红外二区发射光敏剂中构建分子内电场，以实现高效的耐缺氧癌症 I 型光动力疗法 / 光热疗法光热诊疗。通过简单的偶联反应精心设计并制备了三种近红外二区发射的 D-A-D 型有机半导体分子（OTT、BTT 和 BTT+）。这三种光电子分子均具有典型的近红外吸收特性，可用于深层组织光声成像，同时具备近红外二区发射信号，可用于高分辨率长波长荧光成像。有趣的是，带有阳离子化吡啶取代基的 BTT+ NPs 比 OTT 和 BTT 具有更高的近红外二区量子产率和光热效应。将 BTT 中的吡啶单元阳离子化为甲基吡啶鎓阳离子得到 BTT+，其具有较高的局部电子密度，有利于电子转移过程，从而加速以・OH 生成为主的 I 型光敏化过程。此外，阳离子化的 BTT + 具有线粒体靶向能力，进一步提高了光动力治疗性能。体内实验表明，这种优化的光热诊疗剂能够实现体内光声成像 / 近红外二区成像辅助的高效 I 型光动力疗法 / 光热疗法抗肿瘤疗效，且副作用较低。
参考文献
Constructing Intramolecular Electric Fields in NIR-II-Emissive Photosensitizers to Regulate the Local Electron Density for Boosting Hypoxia-Tolerant Cancer Phototheranostics,Xiaoming Hu1, Cheng Zhang , Jingqi Lv , Rongtian Li, Achen Qin , Caijun Zhu , Fengwei Sun1 , Zejing Chen , Shenghan Teng, Hongxin Lin *, Zhen Yang1* & Wei Huang*,CCS Chem. , https://doi.org/10.31635/ccschem.024.202405072
