内容提要
本问题提出一种聚集诱导发光体（AIEgen）- 细菌杂交仿生机器人，由多功能 AIEgen（INX-2）和大肠杆菌 Nissle 1917（EcN）组成，即 EcN@INX-2。EcN@INX-2 仿生机器人展现出近红外二区（NIR-II）荧光发射特性，并具备高效的光动力和光热效应，以及肿瘤靶向能力。这些特性通过 INX-2 和 EcN 的互补作用得以实现。该机器人通过激活抗肿瘤免疫、光动力和光热治疗等多种机制，成功实现了雌性小鼠结肠癌模型的体内多模式成像与治疗。
光敏剂的合成与表征
我们设计并合成了两种光敏剂（即 INX-1 和 INX-2）。通过紫外 - 可见 - 近红外（UV-NIR）和光致发光（PL）光谱分析了 INX-1 和 INX-2 的吸收和发射特性。INX-1 和 INX-2 均表现出扩展的吸收波长。值得注意的是，INX-2 的发射波长延长，部分发射光谱位于近红外区域（NIR-II 窗口），从而便于其在 NIR-II 荧光成像中的应用。因此，选择 INX-2 进行后续实验。随后，通过监测 INX-2 在二甲基亚砜（DMSO）/ 甲苯混合溶剂中随甲苯分数（f_toluene）变化的荧光，研究了其 AIE 特性。观察到 INX-2 在纯 DMSO 溶剂中荧光较弱，随着甲苯分数的增加，荧光逐渐增强，表明其具有良好的 AIE 倾向。随后，对 INX-2 的光热效应进行了研究。在激光照射（660 nm，0.45 W/cm²，5 分钟）下，温度随 INX-2 浓度的增加成比例升高，光热转换效率（η）为 46.26%。通过测量 680 nm 至 970 nm 波长范围内的光声信号强度，得到 INX-2 在 735 nm 处有较强的光声信号。
根据光敏剂（PS）与氧气相互作用的不同机制，活性氧（ROS）可分为 I 型和 II 型。三重态光敏剂通过电子转移生成 I 型 ROS，主要包括超氧阴离子自由基（O₂·−）、过氧化氢（H₂O₂）和羟基自由基（・OH）。相比之下，II 型 ROS 主要由氧气通过能量转移产生的单线态氧（¹O₂）组成。我们进一步利用荧光探针，研究了 INX-2 在聚集态（DMSO / 磷酸盐缓冲液（PBS），体积比 1/99）中经激光激发产生活性氧的能力。首先使用商用试剂 2',7'- 二氯二氢荧光素二乙酸酯（DCFH-DA）作为综合性 ROS 指示剂，评估 INX-2 的整体 ROS 生成能力。当 DCFH 与光敏剂的混合物接受激光照射（660 nm，0.45 W/cm²，10 分钟）后，氧化产物 DCF 在 525 nm 处的荧光强度显著增强。值得注意的是，与初始荧光强度相比，商用光敏剂二氢卟酚 e6（Ce6）和 INX-2 处理组的荧光强度分别提升了 100 倍和 550 倍。
研究采用多种活性氧荧光探针，解析 INX-2 在激光（660 nm，0.45 W/cm²，10 分钟）照射下产生的具体 ROS 类型。其中，单线态氧传感器绿（SOSG）和 9,10 - 蒽二基双（亚甲基）二丙酸（ABDA）用于检测 ¹O₂，羟基苯基荧光素（HPF）用于鉴定・OH，二氢罗丹明 123（DHR123）用于检测 O₂·−。结果显示，Ce6 与 SOSG 的混合溶液在激光照射后，荧光强度迅速上升；而相同条件下，INX-2 处理组的 SOSG 荧光强度仅出现微弱变化。类似地，Ce6 存在时 ABDA 的吸收峰逐渐下降，而 INX-2 处理组的 ABDA 吸收峰仅轻微降低。SOSG 和 ABDA 的检测结果表明，INX-2 在溶液中仅产生极少量 ¹O₂。相反，在 INX-2 作用下，HPF 在 525 nm 处的荧光强度提升了 23.8 倍，DHR123 在 525 nm 处的荧光强度增强了 14.7 倍，表明 INX-2 可在溶液中有效生成・OH 和 O₂·−。
通过电子自旋共振（ESR）光谱分析（使用 4 - 氨基 - 2,2,6,6 - 四甲基哌啶（TEMP）或 5,5 - 二甲基 - 1 - 吡咯啉氧化物（DMPO）作为捕获剂）进一步证实，INX-2 在氙灯照射（300 W/cm²，5 分钟）下几乎不产生 ¹O₂，但能生成大量・OH和 O₂−，这与上述荧光探针的检测结果吻合。综合实验验证表明，与 Ce6 相比，INX-2 主要通过 I 型机制产生活性氧，从而能够在有限氧环境中发挥更佳效能。因此，INX-2 在实体肿瘤治疗中展现出显著优势。
聚集诱导发光体 - 细菌杂交仿生机器人
本研究我们使用益生菌 EcN 作为 INX-2 的递送载体。共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）图像显示，INX-2 分子在共孵育 30 分钟后定位于细菌的细胞质和表面。在利用细菌作为治疗剂载体时，确保细菌的活力是一个关键问题。通过评估 600 nm 处的光密度（OD）来监测 EcN 在液体培养基中的生长动态，该光密度可作为细胞悬浮液浊度的衡量指标。对生长曲线的分析表明，经 INX-2 修饰的 EcN 细菌（EcN@INX-2）表现出典型的增殖和分裂特性，其活力与未修饰的 EcN 之间仅存在轻微可辨的差异。EcN@INX-2 的 zeta 电位测定为−12.83±1.75 mV，负电性略低于 EcN 的−15.73±0.32 mV。这种差异可能归因于带正电荷的 INX-2 对 EcN 表面的有效修饰。紫外吸收光谱分析显示，EcN@INX-2 呈现出与 INX-2 相同的特征吸收峰，表明 INX-2 已附着并包裹在 EcN 表面。通过流式细胞术检测了不同时间间隔内固定在细菌表面的 INX-2 分子发出的荧光信号，发现共孵育 24 小时后荧光强度保持不变，表明 INX-2 与细菌稳定结合。这些结果共同表明，INX-2 通过静电吸附作用附着在细菌表面，成功形成稳定的 AIEgen - 细菌仿生机器人 EcN@INX-2。为了定量表征单个 EcN 对 INX-2 的负载能力，我们构建了标准曲线，计算得出单个细菌的分子负载量为 0.146 pg，负载效率为 96.7%。此外，EcN@INX-2 经三次水洗后仍能保持结合稳定性。结果发现，INX-2 与 EcN 结合后，EcN@INX-2 的 ROS 释放和光热性能略有下降。然而，尽管随着细菌的每次分裂，单个细菌内的 INX-2 浓度被稀释，但整个细菌培养物的集体光热效应仍与初始状态相当。这一发现表明，尽管存在稀释效应，细菌群体的集体光热响应仍得以维持。
为评估 INX-2 的潜在抗菌效能，我们研究了其与细菌细胞的直接相互作用。将不同处理组的细菌悬液接种于 LB 琼脂平板上培养 24 小时，通过菌落计数确定细菌增殖情况。在无激光照射条件下，细菌生长未受影响；而在激光照射（660 nm，0.45 W/cm²，10 分钟）后，细菌数量显著减少。为进一步验证 INX-2 的杀菌功能，我们采用 SYTO 9 绿色和碘化丙啶（PI）红色荧光核酸染料进行细菌 viability 检测。结果显示，在激光照射下，死亡的 EcN 细胞数量呈剂量依赖性增加，证实了 INX-2 的抗菌潜力。值得注意的是，透射电子显微镜（TEM）图像显示，INX-2 吸附前后 EcN 的形态未发生改变，但在激光照射后，负载 INX-2 的 EcN 细胞壁和细胞膜出现结构崩解。
聚集诱导发光体 - 细菌杂交仿生机器人的体外评估
基于 INX-2 优异的光动力和光热特性，EcN@INX-2 的体外抗肿瘤效应已得到验证。采用传统的 3-(4,5 - 二甲基噻唑 - 2 - 基)-2,5 - 二苯基溴化四唑（MTT）法评估细胞活力。将 CT26 细胞与不同浓度的 EcN@INX-2 共孵育，随后进行激光照射（660 nm，0.45 W/cm²，10 分钟）或保持黑暗条件。值得注意的是，EcN@INX-2 + L 组（激光处理组）对 CT26 细胞表现出显著的细胞毒性，细胞活力呈现浓度依赖性下降。研究表明，光动力疗法（PDT）诱导的活性氧（ROS）和光热疗法（PTT）介导的肿瘤损伤可触发免疫原性细胞死亡（ICD）级联反应，从而增强肿瘤对免疫治疗的敏感性。因此，我们探究了 EcN@INX-2 + L 组在体外诱导 ICD 的能力。免疫荧光成像显示，与 PBS 组和单纯激光照射组相比，EcN@INX-2 + L 组显著促进癌细胞表面钙网蛋白（ecto-CRT）的暴露。此外，与对照组相比，EcN@INX-2 + L 组细胞核内高迁移率族蛋白 B1（HMGB1）的荧光强度显著降低，表明该处理促进了 HMGB1 从细胞核释放。这些结果表明，EcN@INX-2 + L 处理 CT26 细胞后，ecto-CRT 表达显著增加，HMGB1 表达显著减少，与共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）观察结果一致。这些发现提示，EcN@INX-2 + L 能够有效诱导肿瘤细胞发生 ICD，这对于增强肿瘤抗原呈递和 T 淋巴细胞激活至关重要。
基于体外实验的积极结果，我们进一步拓展研究，利用 CT26 细胞的 3D 球体模型评估 EcN@INX-2 的肿瘤穿透能力和细胞毒性。将 3D 肿瘤球体分别用 INX-2 和 EcN@INX-2 处理 12 小时，随后通过共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）进行 Z 轴层扫。结果显示，游离 INX-2 处理后，红色荧光信号主要定位在球体表面；相比之下，EcN@INX-2 处理的肿瘤球体内层检测到荧光，表明 EcN 显著增强了 INX-2 的渗透能力。这一现象突显了 AIEgen - 细菌杂交仿生机器人在改善深部肿瘤组织治疗效果方面的潜力。
在各制剂孵育 12 小时后，对 3D 肿瘤球体进行激光照射（660 nm，0.45 W/cm²，10 分钟），并使用 LIVE/DEAD 细胞活力 / 细胞毒性检测试剂盒评估球体内的细胞活力。值得注意的是，EcN@INX-2 + L 处理的 3D 肿瘤球体全层（包括内部区域）均出现广泛细胞死亡。相反，INX-2 + L 处理仅诱导球体最外层细胞死亡。PBS、PBS + L、INX-2 和 EcN@INX-2 处理对细胞活力影响极小。这些结果表明，EcN@INX-2 能够穿透 3D 肿瘤球体的核心区域，在激光照射下有效清除缺氧区域并消融 CT26 细胞。
EcN@INX-2 在体内肿瘤治疗中的应用
鉴于 EcN@INX-2 显著的肿瘤靶向能力，我们进一步评估了尾静脉注射后激光照射下 EcN@INX-2 的体内抗肿瘤效应。成功建立 CT26 荷瘤雌性小鼠模型，并随机分为以下实验组：（I）PBS 组；（II）PBS + 激光（PBS+L）组；（III）EcN 组；（IV）INX-2 组；（V）INX-2 + 激光（INX-2+L）组；（VI）EcN@INX-2 组；（VII）EcN@INX-2 + 激光（EcN@INX-2+L）组。静脉注射后 1 天进行激光照射（660 nm， 0.45 W/cm²，10 分钟）。在整个治疗过程中，每两天监测各实验组小鼠的体重和肿瘤生长情况。结果显示，EcN@INX-2+L 组的肿瘤生长受到显著抑制，观察结束时平均肿瘤体积仅为 33.83 mm³，远小于 INX-2+L 组（908.31 mm³）和 PBS 组（1417.89 mm³）。治疗后 EcN@INX-2+L 组的平均肿瘤质量仅为 18.38 mg，显著低于 PBS 组（937.286 mg）。EcN@INX-2+L 组优异的抗肿瘤疗效主要归因于 EcN 的靶向作用以及 INX-2 的光动力（PDT）和光热（PTT）效应。
体内肿瘤的光免疫治疗
在研究各制剂给药后的免疫反应时，我们评估了肿瘤组织中树突状细胞（DCs）的激活情况。流式细胞术结果显示，EcN@INX-2 + L 组的 DC 成熟度显著增强（MHC-II⁺CD11c⁺ DCs 占比 15.5%），分别是对照组（3.4%）、EcN 组（8.9%）和 INX-2 + L 组（9.2%）的 4.62 倍、1.72 倍和 1.69 倍。细胞毒性 T 淋巴细胞（CTL，CD3⁺CD8⁺ T 细胞）和辅助性 T 细胞（CD3⁺CD4⁺ T 细胞）在适应性免疫调节中起关键作用。EcN@INX-2 + L 组中活化的 CD3⁺CD8⁺ T 细胞比例（22.3%）分别是对照组、EcN 组和 INX-2 + L 组的 3.66 倍、1.91 倍和 2.14 倍。此外，除招募 CTL 外，EcN@INX-2 + L 组还促使肿瘤内辅助性 T 细胞（17.1%）显著增殖，较对照组增加 3.33 倍。这些结果表明，EcN@INX-2 + L 组有效触发了免疫应答，这是启动抗肿瘤免疫的关键步骤。我们进一步通过免疫荧光染色检测了肿瘤切片中免疫原性细胞死亡（ICD）的代表性生物标志物（如 HMGB1 和 ecto-CRT）。结果显示，EcN@INX-2 + L 组的细胞核 HMGB1 表达显著减少，ecto-CRT 表达显著增加。此外，免疫荧光染色显示，EcN@INX-2 + L 组的肿瘤切片中富含 CD11c⁺ DC 细胞、CD4⁺辅助性 T 细胞和 CD8⁺细胞毒性 T 细胞。这些结果共同表明，EcN@INX-2 + L 有效刺激了抗肿瘤免疫反应，增加了阳性免疫应答细胞的浸润，最终抑制了肿瘤生长。
总结
本研究通过精细调控有效的分子内电荷转移效应和抗衡离子效应，合成了新型聚集诱导发光体（AIEgen，INX-2）。INX-2 表现出引人注目的特性，包括长波长吸收、近红外二区（NIR-II）荧光、优异的光热和光声特性，使其成为结肠癌多模态光诊疗的理想荧光分子。为了促进高效递送和结肠癌靶向，INX-2 进一步与肿瘤靶向细菌 EcN 结合。体内评估充分表明，最终构建的仿生纳米材料可通过 NIR-II 荧光成像 - 光声成像 - 光热成像多模态成像，像 “AIEgen - 细菌杂交仿生机器人” 一样实现肿瘤缺氧区域靶向，并通过光疗协同作用诱导肿瘤消融。鉴于这种细菌修饰策略的便利性和可行性，我们的研究提出了一种仿生 “一站式” 光热纳米平台，为增强抗结肠癌疗效开辟了一条有前景的途径。
参考文献
Aggregation induced emission luminogen bacteria hybrid bionic robot for multimodal phototheranostics and immunotherapy,Liwei Zhu, Guangjie Song, Wentian Zhang , Yifan Wu, Yuling Chen, Jiayi Song , Deliang Wang , Guoxin Li , Ben Zhong Tang & Ying Li , Nat. Commun.| (2025) 16:2578,https://doi.org/10.1038/s41467-025-57533-y
