内容提要
本研究基于半花菁染料Icy-P开发了一种光敏剂，其特征在于天然靶向线粒体的阳离子结构。Icy-P在其活性位点含有CYP 2 J2识别受体，将氨基甲酸乙酯定位在Icy-P的识别基团附近，在CYP 2 J2识别时启动级联反应，导致形成醌中间体，其经历1，4-加成反应。该反应促进Icy-P与酶的结合，Icy-P在肿瘤细胞内的体内停留时间为48 h至7 d。此外，Icy-P在光照下产生活性氧，导致线粒体损伤、半胱天冬酶-1活化和gasdermin D裂解，最终诱导细胞凋亡，从而增强癌症治疗的功效。
Icy-P的设计与合成
一种具有近红外吸收/发射和上级生物相容性的半花菁染料被选作支架。在染料中引入碘通过重原子效应增强了其ROS生成能力。这是因为碘促进了染料的自选择轨道偶联，这随后增强了系统间的交叉和ROS的产生。化合物中的羟基与4-甲氧基溴反应，减少ROS产生能力，这可能会通过特定的酶促反应而增加。为了延长PS在肿瘤中的保留时间，引入氨基甲酸乙酯作为离去基团，其位于反应位点附近。一旦酶切割识别器，离去基团释放形成醌中间体，随后发生快速的1.4-消除反应，生成醌甲基化物，这是一种高度亲电的化合物，可与CYP 2 J2的亲核基团快速反应（-SH，NH 2），因此，PS通过分子内电荷转移以其活化的荧光形式锚定到酶上。使用花青染料作为起始底物，该化合物与间苯二酚衍生物反应生成前体染料，再与识别基团和离去基团偶联生成Icy-P。
Icy-P对CYP 2 J2的光谱响应及体外共价标记
研究了Icy-P在PBS中的水溶性。Icy-P的最大吸收峰强度与其浓度呈线性相关，表明其具有良好的水溶性。此外，以BSA为底物，评价了Icy-P在PBS中的长期稳定性。48小时后，Icy-P的吸收光谱保持不变，证明其在生理环境中具有良好的稳定性。随后，分析了与CYP 2 J2孵育前后的Icy-P吸收光谱，Icy-P显示出较宽的吸收峰，特别是690 nm处的吸收峰在被CYP 2 J2识别后明显增强。此外，记录了有和无CYP 2 J2孵育的Icy-P的荧光光谱。游离的Icy-P表现出极弱的荧光。相反，在与CYP 2 J2温育后，在725 nm处，Icy-P的荧光强度比游离Icy-P增加了19倍。观察到的增加表明醚键的破坏和分子内电荷转移机制的恢复。结果表明，ICy-P与多种底物（包括生物分子和酶）作用后，在725 nm处的荧光强度明显增强，而在725 nm处的荧光强度明显减弱。正如预期的那样，仅与CYP 2 J2孵育可导致荧光显著增强，而其他底物对荧光增强无影响。此外，随着CYP 2 J2浓度的增加，725 nm处的荧光强度逐渐增加。结果表明，CYP 2 J2对Icy-P的激活具有高度的选择性，这在荧光介导的PDT中具有潜在的应用价值。为了确定CYP 2 J2激活的Icy是否能够产生ROS，我们使用了1，3-二苯基异苯并呋喃作为单重态氧传感器，在仅冰组中未观察到吸光度的显著变化;然而，Icy-CYP 2 J2组的吸光度降低，表明Icy-P产生的ROS依赖于CYP 2 J2对其的激活。使用亚甲基蓝作为参考，计算出Icy-P和Icy-OH的单线态氧的产率分别为1.7%和0.3%。此外，我们利用电子顺磁共振光谱法验证了CYP 2 J2光诱导激活后，Icy-P产生的单线态氧。此外，pH水平的变化对Icy-P的荧光强度无显著影响。
细胞摄取和ROS检测
在酶激活和标记方面取得了令人鼓舞的结果之后，采用基于细胞的成像和光疗来检查Icy-P的特性。首先，进行荧光成像以分析HepG 2细胞中CYP 2 J2的表达水平（高表达），MCF-7细胞（中等表达）和非洲绿色猴肾细胞（COS-7，低表达），在孵育Icy-1后进行荧光成像。结果显示，HepG 2细胞的荧光强度最高，MCF-7细胞次之，COS-7细胞几乎无荧光，说明CYP 2 J2在HepG 2细胞中高表达，第二，在HepG 2细胞中检查了Icy-P和不含标记部分的对照剂Icy-C的细胞摄取。随着时间的推移，荧光信号在用Icy-P或Icy-C处理的细胞中显示出显著差异。在孵育5分钟内，荧光信号是可检测的，结果表明，两种PS均被肿瘤细胞迅速内化，Icy-P的荧光信号在孵育1-4 h后达到最大值，并在12 h内保持稳定，48 h后仍有微弱的荧光信号;但是，在此情况下，对照分子Icy-C的荧光信号在孵育4小时后显著降低，并在8小时后完全消失。这是由于Icy-P被CYP 2 J2激活并随后与相邻蛋白质共价结合。有趣的是，在摄取实验期间，在对照组或Icy-P组中没有观察到细胞形态的显著变化。然而，在IcyP+Light组中，观察到细胞形态的明显转变，细胞表现出肿胀，伴随着细胞膜周围出现气泡。
体外细胞毒性评估
Icy-P的上级线粒体靶向能力和CYP 2 J2的特异性激活表明Icy-P是一种有前途的PS。为了评估Icy-P的光毒性，我们使用先前建立的细胞系进行了进一步的实验（COS-7，MCF-7，HepG 2）细胞中CYP 2 J2的表达水平不同，与不同浓度的Icy-P共孵育后，细胞存活率超过90%，表明良好的生物相容性在与细胞共孵育并暴露于光后，PS被认为是细胞毒性的，其中HepG 2细胞是最敏感的，Icy-P对MCF-7和COS-7细胞的抑制作用最强，其次是MCF-7和COS-7细胞，Icy-P的作用与细胞内CYP 2 J2的表达呈正相关，Icy-P的半数抑制浓度（half-maximalinhibitoryconcentration，LC-E）与细胞内CYP 2 J2的表达呈负相关，LC-E与细胞内CYP 2 J2的表达呈负相关。结果表明，Icy-P对HepG 2细胞的杀伤作用最小，为2.5 μm，提示Icy-P可被CYP 2 J2选择性激活。（活细胞在绿色荧光中，死细胞在红色荧光中）。Icy-P处理组和Icy-P处理组均显示出较强的绿色荧光，而光照组Icy-P显示出明亮的红色荧光，表明Icy-P在光照下具有良好的生物相容性和较高的光毒性。关注其通过PDT诱导焦亡的能力。与对照组和有光对照组相似，Icy-P处理组中的细胞存活率超过90%。相反，当Icy-P暴露于光照射时，没有观察到活细胞。在肿瘤细胞中，Icy-P被CYP 2 J2激活，促进其锚定到线粒体上，这最终导致线粒体损伤和暴露于光时的焦亡。
ICD和Icy-P诱导的焦亡
Pyroptosis通过触发促炎细胞因子的释放来增强细胞反应性。为了评估IcyP诱导ICD的能力，我们量化了两个关键的生化指标：通过免疫荧光染色确定HMGB 1的释放和CRT表达对照组、光对照组和Icy-P处理组在细胞核中显示出明亮的荧光信号。Icy-P光处理组导致HMGB 1从细胞核释放到细胞外空间的显著增加。Icy-P光处理组在细胞质中显示明亮的绿色荧光信号，表明与Icy-P孵育的HepG 2细胞释放抗原呈递细胞的“吃我”信号，而其他组则没有。测量了IL-1β和IL-18（与炎症和焦亡相关的两种典型细胞因子）的水平。Icy-P和光照处理的HepG 2细胞培养液中IL-1和IL-18水平升高，提示Icy-P诱导的细胞凋亡引发了炎性细胞因子的释放，此外，还检测了乳酸脱氢酶（LDH）和三磷酸腺苷（ATP）浓度的��变化。暴露于Icy-P处理与光组合的细胞表现出升高的LDH和ATP释放水平，而对照组和具有光的对照组中的那些显示出可忽略的变化。为了进一步理解Icy-P诱导的焦亡的潜在机制，进行蛋白质印迹分析以评估HepG 2细胞中GSDMD和半胱天冬酶-1蛋白的表达水平。结果显示，对照组和Icy-P处理组的N端GSDMD和裂解型caspase-1均无明显表达，而Icy-P光照处理组的N端GSDMD和裂解型caspase-1表达明显，表明caspase-1的激活和随后的GSDMD的裂解有助于Icy-P-本研究结果表明，线粒体靶向PDT通过线粒体损伤诱导细胞凋亡。总的来说，Icy-P在光暴露后迅速内化到肿瘤细胞中并定位在线粒体中，Icy-P介导线粒体损伤，激活细胞凋亡途径，切割GSDMD，刺激免疫因子释放，最终导致细胞膜破裂和细胞内容物渗漏，另外，HMGB 1和CRT的释放，进一步支持Icy-P诱导细胞死亡的免疫原性。
体内成像和抗肿瘤治疗
基于Icy-P在体外的有希望的结果，我们评估了其在体内的治疗效果。在瘤内注射Icy-P后，观察到荧光迅速增加。注射后约4小时达到峰值，表明PS在肿瘤组织中的有效积累。Icy-P在肿瘤部位保持了长达168小时的强大荧光信号，这对PDT是有利的。这是因为PS在延长的时间段内保持可用于光照射激活，从而提供了延长的治疗窗口。我们测量了Icy-P的抗肿瘤活性。将所有携带HepG 2肿瘤的小鼠随机分配到四组之一：对照、有光的对照、Icy-P处理和有光的Icy-P处理。测量经受不同处理的小鼠中的肿瘤体积。Icy-P治疗组显示出对肿瘤生长的最小影响。类似地，具有光的对照组没有显示出显著的抗肿瘤作用，证实了所施加的光剂量的安全性。值得注意的是，在Icy-P用光处理组的小鼠中，肿瘤生长受到抑制，这表明IcyP在体内有效地抑制肿瘤生长。此外，离体肿瘤质量分析表明Icy-P在光暴露后对肿瘤具有显著的抑制作用。确定活体肿瘤内的焦亡是否触发ICD，对经过各种处理的肿瘤组织进行免疫荧光染色。在HMGB 1的免疫荧光染色中，对照组、光对照组和Icy-P处理组显示出强烈的荧光。相反，Icy-P光处理组显示出最小的荧光信号或没有荧光信号。在CRT的免疫荧光染色中，对照组、光照对照组和Icy-P处理组显示最小荧光;然而，Icy处理与光组显示出明显的绿色荧光信号。综上所述，这些结果表明，Icy-P与光照射的组合有效地诱导体内焦亡，从而抑制肿瘤增殖。因此，Icy-P介导的PDT通过焦亡刺激自身免疫反应。重要的是，这些发现突出了PS介导的PDT在体外和体内通过突眼抑制肿瘤增殖和增强自身免疫应答的潜力。另外，在治疗观察结束时进行的处死的肿瘤组织的Tunel和Ki 67染色一致地证实了“Icy-P用光处理”组具有最好的抗肿瘤功效，并且诱导的肿瘤细胞显示出显著的肿瘤坏死区域，表明与其它组相比增强的抗肿瘤效果。
总结
我们设计了一种CYP 2 J2激活的PS，Icy-P，其有效地靶向线粒体，并在激活后与线粒体蛋白形成共价键，从而延长滞留时间。Icy-P在肿瘤细胞内的滞留时间>48 h。其在肿瘤内注射后在体内的滞留时间可长达7 d。更重要的是，Icy-P在光照射下诱导线粒体损伤，激活caspase-1和GSDMD，导致靶细胞的焦亡，这一过程导致大量免疫原性因子如HMGB 1、ATP、IL-1β和IL-18的释放，这为显著增强抗肿瘤疗效提供了巨大的希望。
参考文献
A CYP2J2-Activated Photosensitizer with In Situ Enzyme Anchoring Induces Pyroptosis in Cancer Therapy,Xiang Xia, Ran Wang, Yingqi Hu, Hua Gu, Wen Sun,* Jiangli Fan,* and Xiaojun Peng,Adv. Funct. Mater. 2025, 2422823,https://doi.org/10.1002/adfm.202422823
