内容提要
本工作设计了一种NIR-II D-p-A-p-D探针SCU-SX-T，该探针以S-氧杂蒽为共轭受体，以二苯胺（DPA）为转子，以p-桥为桥，在提高分子刚性和平面性的同时，引起吸收/发射光谱的红移，这种合理的分子设计使探针的最大光电转换效率达到91.5%和荧光量子产率为0.04%。值得注意的是，SCU-SX-T NP促进了腹部区域的高分辨率血管成像和活体小鼠的精确手术，证明了其强大的NIR-II荧光能力。成功实现了NIR-II FLI/光热成像（PTI）引导的肿瘤可视化和光热治疗（PTT）。
结果与讨论
分子设计、合成与光物性质
二苯胺是一种具有转子效应的多功能电子给体，通过荧光猝灭增强非辐射跃迁，从而促进光热转换。通过在氧杂蒽核的10位引入一个S原子，有效地促进了体系间跃迁（ISC）到三重激发态，从而显著提高了活性氧（ROS）的产生。该策略产生了D-A-D结构的化合物SCU-SX。然而，其生物医学应用受到短吸收/发射波长和低MEC的限制。为了解决这些限制，开发了分子设计策略：在氧杂蒽核和3，6-二苯胺单元之间引入p-共轭桥，生成D-p-A-p-D结构的衍生物SCU-SX-B，SCU-SX-F，和SCU-SX-T。p-桥的引入增强了分子刚性和平面性，延长了pp-电子离域。这种结构优化诱导吸收/发射光谱的红移，并大大增强MEC。SCU-SX、SCU-SX-B、SCU-SX-F和SCU-SX-T在不同溶剂中的光学性质，它们的吸收峰从可见光区到近红外-I区，而它们的发射峰从NIR-Ⅰ区延伸到NIR-Ⅱ区，化合物SCU-SX-T的吸收波长约为870 nm，这在NIR-Ⅱ PTA的文献中很少报道此外，由于更强的分子间供体-受体（D-A）相互作用，与SCU-SX-B和SCU-SX相比，SCU-SX-T和SCU-SX-F在波长上显示出更显著的红移。
纳米粒子的制备与表征
为了获得水溶性分子，使用DSPE-mPEG 2000将SCU-SX、SCU-SX-B、SCU-SXF和SCU-SX-T包裹到纳米颗粒中。SCU-SX-T纳米颗粒在814 nm处表现出最佳吸收，在1064 nm处表现出最佳发射。还测试了纳米颗粒的光学性质。纳米颗粒的平均粒径，通过动态光散射（DLS）测量的纳米颗粒的粒径为约50 nm，并且透射电子显微镜（TEM）证实纳米颗粒具有球形形态。另外，SCU-SX-TNP在不同pH条件下和连续曝光30分钟下保持高度稳定。基于这些优异的光学性质，我们观察到在808 nm激光照射下，10 mM SCU-SX-T NP的浓度增加到约70 ℃，这足以完全杀死小鼠中的癌细胞，NP显示出显著的浓度和功率依赖性，计算了SCU-SX-B、SCU-SX-F和SCU-SX-T纳米粒子的光热转换效率。与其他两种NP相比，SCU-SX-T NP表现出更高的PCE JCU-SX-T NP通过五次加热-冷却循环进行测试，并保持了高热稳定性。除了它们的光热性能之外，NP的ROS生成能力也是显著的。使用单线态氧（1 O2）和自由基检测探针，（亚甲基）-二丙二酸（ABDA）几乎保持不变，表明NP主要产生1O2另外，使用二氢罗丹明123（DHR 123）和羟基苯基荧光素（HPF）作为自由基指示剂。所有三种NP都产生超氧化物自由基。SCU-SX-T NP表现出作为PTA的优异的光稳定性。
SCU-SX-T NP的体外抗肿瘤测定
对SCU-SX-T纳米颗粒进行细胞毒性试验。结果表明，纳米颗粒在测试的浓度范围内对4T1细胞没有明显的暗毒性，表现出良好的生物相容性。在808 nm激光照射下，随着纳米粒浓度的增加，细胞存活率显著降低，当SCU-SX-10浓度为100 mg/L时，90%以上的细胞被清除。在与FITC@SCU-SX-T NP孵育12小时后，4 T1细胞膜显示出明亮的绿色荧光信号。用市售荧光探针LysoTrackerRed和Hoechst 33342进行的共染色实验显示大多数染料聚集在细胞膜上，进入溶酶体部分的染料主要通过溶酶体介导的内吞作用内在化。随后，DCFH-DA被用作评估SCU-SXT NP的细胞内ROS产生的指示剂。为了比较，将细胞分为四组：PBSL、PBS + L、NP L、PBS + L和PBS + L。结果表明，与对照组相比，NPs + L组产生非常明亮的绿色荧光，这与体外ROS测定一致。为了进一步评估细胞毒性，将细胞分成四组。在NP + L组中，用808 nm激光以0.33 W cm 2照射细胞。结果显示在0.33W cm-2照射下，在NPs + L组中没有观察到显著的细胞死亡。与此相反，在NPs + L组中，几乎所有的4 T1细胞在1W cm- 2照射后死亡。SCU-SX-T NPs介导的肿瘤细胞杀伤可能主要来源于PTT。本研究表明，在SCU-SX-T NPs介导的4T1细胞杀伤中，光热疗法（PTT）是诱导细胞死亡的主要机制，而光动力疗法（PDT）起辅助作用。为了进一步评估对线粒体膜电位的影响，结果显示NPs + L破坏了线粒体膜电位，导致细胞凋亡。结果显示在用808 nm激光照射结合SCU-SX-T NP处理后，约13.6%的癌细胞经历早期凋亡，实验结果表明，纳米粒子具有良好的生物相容性，在808 nm激光照射下，纳米粒子主要通过PTT诱导肿瘤细胞死亡。
荧光引导和体内成像
对于每组实验，4T1乳腺癌荷瘤小鼠通过尾静脉给予200 mL SCU-SX-T NP（1 mg mL-1），在小鼠体内进行了全身NIR-II血管FLI的检测，为后续FLI介导的PTT奠定了坚实的基础。全身血管、脑、肾的NIR-II FLI分别为：通过尾静脉注射NPs对小鼠进行背部注射。膀胱的外周血管，肝脏轮廓，并且在950 nm的长通滤光器下可以观察到脑的表面血管。和脑血管（线2）分别为850 mm和900 mm，通过高斯拟合确定。这些结果表明，SCU-SX-T NP具有优异的NIR-II血管成像能力。II配备808 nm激光的体内成像系统注射10分钟后，由于增强的渗透性和保留（EPR）效应，肿瘤组织可以被照亮，这驱动了SCU-SX-T NP在肿瘤部位的被动积累，以及随后的精确手术切除（视频S1和S2）JUSX-T NP随着时间的推移在肿瘤中越来越富集，信号在312小时开始减弱。在预定时间点收集的血液、肝脏和肾脏匀浆的NIR-II荧光成像显示NP的清除显著延迟。这主要归因于DSPE-mPEG 2000修饰所赋予的增强的渗透性和保留（EPR）效应及其纳米级颗粒尺寸特性，其显著延长了探针在血流中的循环时间并减缓了其在肝脏和肾脏中的代谢速率。(Fig-NPs主要通过肝脏和肾脏代谢，主要器官的苏木精-伊红（H&E）染色显示无损伤，证实了NPs的优良生物安全性NP在肿瘤中的延长保留归因于SCU-SX-T NP的正电荷静脉内注射，808 nm激光照射5 min后，肿瘤部位的温度从约30 ℃升高到52相反，PBS + L和a-PD-L1 + L组在相同条件下仅表现出可忽略的温度变化。SCU-SX-T NP在肿瘤的NIR-II FLI和PTT双模态成像中表现良好，显著促进了随后的肿瘤部位特异性协同光疗。
与a-PD-L1联合用于SCU-SXT纳米粒的抗肿瘤试验
SCU-SX-T NPs可以在肿瘤中长时间积累，并且使用4 T1小鼠原位模型评估其抗肿瘤潜力。将小鼠分成七组：PBS L、PBS + L、NPs L、NPs + L、a-PD-L1 L、a-PD-L1 + L和NPs + a-PD-L1 + L。在尾静脉注射12 h后，用808 nm激光以0.45 W cm 2照射肿瘤部位5 min。对于a-PD-L1 L、a-PD-L1 + L和NPs + a-PD-L1 + L组，在第1、3和5天通过尾静脉注射施用a-PD-L1以阻断PD-L1产生。NP + L和NP + a-PD-L1 + L显著抑制肿瘤体积和体重变化。生长，其中一些组实现了完全的肿瘤消融。相比之下，对照组中的肿瘤继续生长而没有抑制。单独的NP表现出优异的光热效应，并且NP + L和NP + a-PD-L1 + L都有效地抑制了肿瘤生长。证明NP + a-PD-L1 + L的组合阻断了PD-L1的产生，治疗15天后，来自NP + L和NP + aPD-L1 + L组的肿瘤切片的H&E染色显示肿瘤细胞中显著的空泡化和核浓缩，为了评估a-PD-L1在抗癌过程中的作用，使用流式细胞术（FCM;门控策略显示）测量分离的肿瘤组织中细胞毒性T淋巴细胞（CD 8 + T细胞，CTL）的比例。NPs + a-PD-L1 + L组的CD 8 + T细胞比例显著高于对照组免疫组化染色结果与FCM结果一致（H-N），表明NP + a-PD-L1 + L介导的PTT激活了CD 8 + T细胞增殖，这有助于抑制肿瘤生长。用酶联免疫吸附测定（ELISA）进行全身性细胞因子分析，用NPs + a-PD-L1 + L组合方案治疗的小鼠表现出显著升高的促炎细胞因子血清水平（干扰素-g（IFN-g），肿瘤坏死因子-a（TNF-a），和白细胞介素-6（IL-6））（A-C）。这些结果证明NP + L-介导的PTT有效地激活T细胞免疫应答。掺入α-PD-L1免疫检查点阻断剂通过肿瘤微环境的免疫原性调节协同增强抗肿瘤免疫力，导致针对原发性肿瘤的治疗功效显著改善。
总结
本研究以S氧杂蒽为电子受体、DPA为转子和供体、p桥为桥，通过合理设计合成了一系列具有近红外I ~ II荧光发射的荧光团SCUSX、SCU-SX-B、SCU-SX-F和SCU-SX-T，其中SCU-SX-T具有超高的MEC。SCU-SX-T纳米粒具有较高的PCE（91.5%）、良好的生理稳定性和生物相容性，且SCU-SX-T纳米粒具有较强的D-A相互作用，可发射近红外-II荧光，并可在一定范围内延伸。体内NIR-II成像证实，SCU-SX-T NPs可以描绘小鼠腹部血管系统，能够清晰地描绘肿瘤边缘，并随后在活体小鼠中进行精确的手术切除。最终，在808 nm激光照射下，成功实现了NIR-II/PTI引导的肿瘤成像和PTT。
参考文献
p-Bridge engineering strategy: tailoring S-xanthene dyes with strong absorption for high-efficiency photothermal therapy，Yu Zhao,Rui-Rui Zhang, Nan Wang, Xiao-Li Tian, Li-Na Zhang,Wen-Li Xia,Zhou-Yu Wang,Xiao-Qi Yu *and Kun Li *，Mater. Horiz，DOI: 10.1039/d5mh01254f.
