内容提要
我们设想了对称的 A-π-D-π-A 荧光团，通过乙烯基 π 桥将两个阳离子电子受体 1,3,3-三甲基-3H-吲哚鎓分子与不同的电子供体芳香族核心连接起来。与最常用的中性结构单元相反，使用带正电的结构单元作为受体单元可提高染料的水溶性，并促进其与生物介质的结合。对这些系统性修饰衍生物进行的深入光谱分析使我们能够表征它们执行双光子吸收（2PA）的能力。通过将这些分子与活细胞培养，证明了它们在生物成像方面的应用。荧光显微镜显示，这些 2PA 二价染料可选择性地染色线粒体。线粒体通常被称为细胞的 "动力室"，是细胞能量代谢的核心。线粒体也是亚细胞水平活性氧的主要来源，活性氧虽小，但却是参与生理和病理过程的关键介质。
化合物的合成和光物理性质
化合物 1-4 是通过市售芳香族二甲醛与 1,2,3,3- 四甲基-3H-吲哚鎓碘化物之间的克诺文纳格尔缩合反应合成的。与噻吩对应物 3 和 4 相比，以苯基为核心的染料 1 和 2 显示出蓝移吸收最大值。3 号和 4 号染料的这种红色偏移表明，当加入电子负载更大的噻吩基核心时，带隙会减小，并间接表明这些分子的供体-受体特性增强。与 3 相比，4 中引入的额外噻吩基团扩展了 π 共轭体系，并使其吸收最大值进一步发生红移。不过，在比较 2 和 1 时，并没有观察到这种效应。事实上，2 的吸收略微偏蓝。值得注意的是，在研究这些化合物的荧光特性时也发现了类似的趋势。对 DFT 优化几何结构的分析也支持这种最大吸收带的趋势。2 结构灵活性的增加解释了为什么电子密度重叠和从中心苯基向双（吲哚）基团分散的程度降低，以及随后出现的蓝移频带。使用不同溶剂获得的吸光度和荧光光谱显示，当改变溶剂极性时，吸光度和荧光光谱的位置会发生某些变化。随着溶剂极性的增加，吸光度和荧光最大值会发生蓝移。这种现象并不常见，因为当溶剂极性增加时，传统 2PA 染料的发射通常会发生浴色偏移。在这些情况下，由于基态的偶极矩/四极矩比激发态的偶极矩/四极矩大，因此吸光度会发生蓝移。我们的分子在所有研究溶剂中都获得了荧光量子产率它们的产率非常低，从 0.001 到 0.023 不等，在 3 和 4 中的荧光量子产率最高。
多光子研究
我们通过双光子诱导荧光方法在 700-1000 nm范围内探索了这些化合物的 2PA 特性。不过，有必要说明的是，在这些分析中，相关的优点是双光子截面乘以荧光量子产率的乘积。因此，尽管荧光量子产率不高，但我们的化合物（尤其是 4 号化合物）具有较大的双光子截面，能够以较高的信噪比清晰地观察到双光子荧光。所研究分子的 2P 激发和 2P 诱导荧光光谱见图 2。我们选择乙腈作为溶剂，因为乙腈广泛用于此类研究，便于与文献数据中以吲哚为受体单位的其他分子进行直接比较。所有分子都显示出两条 2PA 带：i) 波长为 700-720 nm 的高强度带，具有显著的 σ2PA；ii) 波长为 ≈890 nm 的次要特征，强度较低。需要强调的是，在所有情况下，2PA 诱导的荧光都与单光子激发时观察到的荧光相似。这证实了发射并不依赖于垂直填充的电子激发态，而是依赖于第一激发态，第一激发态根据卡沙规则通过 S2→S1 内部转换迅速填充。此外，发射强度与激光功率的关系进一步证实了这种发射的双光子起源（见图 S4，佐证资料）。在双对数坐标图中的这种表示显示所有分子的斜率约为2的直线，这无疑对应于双光子过程。此外，分子3和4的2PA激发光谱在700 nm处的急剧下降，有助于排除共振效应的存在（因为对于这两种分子，1PA和2PA在≈700 nm处重叠）。重要的是，获得的σ2PA值与其他先进相关结构所描述的数值相当。
在传统的中性染料中，激发会导致中性激发态通过 ES-SB 过程演变成极化电子分布。从局部来看，这种 ES-SB 激发态的极性明显高于中性基态，因此在很大程度上会被极性溶剂所稳定，从而减小了光学能隙，导致极性溶剂中的荧光较非极性溶剂中的荧光发生红移。我们的双阳离子染料的情况有所不同，因为它们的基态本身就是极性的。在 S0 中，空间上分离的吲哚阳离子允许溶剂分子有效地溶解电荷。然而，在 ES-SB S1 状态下，由于正电荷的空间间隔较小，溶剂分子在溶解的第一球中过于拥挤，从而降低了溶解效率。这些因素共同导致 S0 状态相对于 SB S1 状态更加稳定，最终增加了从极性介质到极性介质的光隙。这就是随着溶剂极性的增加而出现荧光带蓝移的根本原因。
生物成像细胞研究
我们对它们在活细胞中的性能进行了研究。首先将 1-4 的 1 μm 溶液与完全培养基中的 HeLa 细胞培养 2 小时，然后用 2P 显微镜对其进行检测。请注意，之前的细胞毒性实验证明这一浓度对 HeLa 细胞无害。我们的染料与 HeLa 细胞的孵育表现出两种不同的行为。1-3 衍生物的荧光呈现出一种特殊的丝状模式，这强烈表明这些衍生物在线粒体中聚集。这种情况在某种程度上是意料之中的，因为在亲脂性结构中加入正电荷已被其他荧光团证明是实现线粒体内选择性聚集的有效策略。因此，我们将注意力集中在深入研究染料 1-3 的性能上。对照实验显示没有明显的背景荧光。为了证实染料 1-3 在线粒体中的分布，我们随后使用商用线粒体追踪器进行了共聚焦研究：MitoTracker Red CMXRos（MTR）或 MitoTracker Green FM（MTG）。展示了这些研究的结果，其中 1 和 2 用绿色表示，MTR 用红色进行反染色。将这两张图片合并来看，所有的荧光都是橙色到黄色，这是绿色和红色通道结合的结果，表明我们的染料和商用染料对线粒体的染色效果相当。根据计算，1 和 2 与商用 MTR 的皮尔逊相关系数（PCCs）分别为 0.80 和 0.78。这些高 PCCs 值表明我们的染料的荧光信号与商用 MTR 之间具有良好的相关性，并证实了这些二阳离子衍生物染色线粒体的能力。当检测品红色的化合物 3 并用青色的 MTG 进行反染色时，也能获得类似的读数。在这种情况下，组合信号显示为蓝色，PCC 为 0.82。
结论
双吲哚鎓染料是一类具有优异双光子吸收（2PA）特性的创新化合物。将噻吩基引入作为供体比苯基更能促进明显的ES-SB反应。此外，延长供体链长显著增强了ES-SB过程：具有单个供体重复单元的化合物ES-SB效率较低，且对应的σ2PA值也较低。活体HeLa细胞的生物成像研究表明，化合物1–3可作为线粒体特异性染料，通过双光子显微镜实现高质量成像。这些染料的性能与商业线粒体标记物相当，尽管其设计更为简便。
参考文献
Counterintuitive Fluorescence Blue Shift in Symmetry Breaking Dicationic Bis(indolium) with Two-Photon Absorption Properties for NIR Living Cell Imaging, Carlos Benitez-Martin, Jose M. Marin-Beloqui, Juan T. López Navarrete, Juan Casado,* Francisco Najera,* and Ezequiel Perez-Inestrosa*, Adv. Mater. 2025, e10730.https://doi.org/10.1002/adma.202510730
