内容提要
我们提出了一种生物正交的原位形成策略，能够在活细胞中精确地、细胞器特异性地激活AIEgen。该系统采用双锁定机制-结合四嗪猝灭和扭曲的分子内电荷穿梭(TICS)动力学-以在前体状态下保持超低荧光背景，即使在聚集条件下也是如此。通过生物正交反应和分子聚集，所得到的AIEgen具有从605到665 nm的可调发射峰、大的斯托克斯位移(高达201 nm)和特殊的荧光增强(高达1033倍)。它们的高生物兼容性和空间精确度允许多路同时标记细胞内靶标。与传统的荧光和生物正交探针相比，这些AIEgen表现出S型扩增反应，能够敏感地区分细微的生物标记物表达差异，并有效地识别疾病进展过程中的受损细胞。这一策略显著提高了活细胞成像的特异性和敏感性，扩大了AIE发光体的功能用途，并为生物医学研究和诊断中的高分辨率、多路生物成像提供了一个通用的平台。
结果和讨论
我们合成了探针1(在β桥的π位置上带有氰基)和不含氰基的参考化合物HF642。在生物正交反应之前，我们观察到探针1在水/DMSO混合溶剂(体积比99：1)中形成了大量的分子聚集体，平均流体力学直径为68 nm。尽管有这种聚集，但背景辐射非常弱。在探针1与环辛炔亲二烯试剂(BCN)反应后，我们检测了产物B-1在不同的水/DMSO混合物中的荧光强度。动态光散射(DLS)测量表明，B-1在水中的平均流体动力学直径为209 nm，表明存在聚集。因此，当水含量(FW)超过70%时，我们观察到荧光显著增加。相反，HF642(logD=5.70)的生物正交产物，即不含氰基的探针1的类似物，显示出随着聚集而荧光强度显著降低。这一区别表明，氰基的引入有效地将华西荧光团的性质从ACQ to AIE转化为AIE。我们研究了具有不同双烯亲和性的原位形成的AIEgen的生物正交化学和生氟性。几种类型的亲二烯化合物已被用于四嗪的生物正交化学中，从而产生了不同的加合物，包括哒嗪和二氢哒嗪及其异构体。探针1首先被用来与四个双烯基团反应，特别是三个跨环辛烯(TCO)衍生物和降冰片二烯(NBD)。我们研究了产物的光物理性质作为溶剂FW值的函数。所有生物正交加合物一般都表现出AIE现象和荧光性质，开启比从30到622倍。1与(E)环辛基-4-烯醇(4E-TCO)反应生成的化合物含有最多的异构体，并产生相对较低的开启比(生成的加合物HT-1的30倍)和较弱的AIE性质。对于以TCO为亲二烯基团的生物正交反应，在随后的芳构化后，我们观察到生成的加合物中有更高的AIE开通率(T-1是90倍)。我们将这一现象归因于通过阻止异构体的形成而实现的有序聚集。与NBD反应生成相对平坦的哒嗪加合物(N-1)，其荧光开启比为33倍，具有较弱的AIE特征。相反，通过使用d-TCO和BCN来增加空间位阻会产生显著更高的翻转比-DT-1是104倍，B-1是622倍。这些结果表明，这些加合物中相邻的八元环有效地抑制了π-π的堆积，从而增强了AIE的发光。基于这一性能，BCN被选为后续研究的最佳双烯亲和剂。
受探针1突出的AIE性质的启发，我们接下来研究了是否可以通过调节给电子体部分和四嗪片段上的取代基来丰富这种新的AIE框架的发射颜色并优化其荧光性能。我们又合成了七个在苯胺供体或四嗪上带有不同取代基的四嗪探针。与探针1类似，经过生物正交反应后，我们观察到大多数加合物中明显的聚集体形成和高达1033倍的AIE发光。有趣的是，所有羟乙基取代的探针都表现出比相应的四嗪基甲基取代的探针更高的开启比(即B-1和B-2)。我们将这种增强归因于羟基带来的溶解度的改善和潜在的更高的反应效率。此外，延长的烷基链可能会阻碍不需要的π-π堆积，从而促进更好的AIE性能。修饰给电子片段也成功地丰富了AIEgen的发射颜色。当使用含有螺旋状三苯胺基团的荧光团时，所生成的AIEgen(B-5和B-6)的发射峰在橙色区域亚色移至605 nm。反之，当取代苯胺时，发射峰向665 nm方向移动，在近红外区域有较强的荧光发射。有趣的是，当我们将叔丁基连接到化合物7和8上时，这两个化合物的AIE效应最不显著。我们的理由是，高度庞大的叔丁基可能会阻止分子聚集体中的有效堆积，从而即使在分子聚集体中也能进行实质性的运动。这种运动可以有效地减弱荧光强度，减弱AIE效应。
在将可激活的抗原应用于生物成像之前，我们评估了它们的生物正交性、生物相容性和活细胞中的稳定性。我们首先确定了诱导AIE所需的B-2的最低浓度。B-2在0.8微米以下的荧光可忽略不计，表明没有明显的AIE。超过这个阈值，荧光显著增强，与AIE的发病相一致。I99/I0比值--定义为含99%水的DMSO/水混合物的发射强度相对于纯DMSO的发射强度--呈现出准S型的急剧增加，表明荧光响应具有浓度依赖性的增强。同样，测量生物正交反应和聚集后的荧光增强的开启比在大约0.8微米处显示出明显的起始值。反应的二级速率常数分别为96.5M−1 S−1和8.57M−1 S−1。所有测试的探针在高达40微米的浓度下对人胚胎肾脏293T细胞和SKOV-3细胞的毒性可以忽略不计。在缓冲条件下孵育24小时后，这些细胞中高达95%的细胞仍然存活。此外，该探针在生理条件下是稳定的。我们还观察到它们保留了荧光AIE特性为了进一步评估原位AIEgen形成策略用于活细胞成像的潜力，我们进行了一系列细胞实验，以评估其荧光性能和生物相容性。我们合成了六种携带BCN和不同锚定部分的生物正交亲双胞菌，分别靶向细胞膜、线粒体、内质网、高尔基体、溶酶体和外源表达的核定位的HaloTag蓝色荧光蛋白(Halo-EBFP2-H2a)。当细胞器靶向的BCN化合物预处理活细胞，然后用不洗涤步骤的探针2处理时，观察到荧光信号的快速发展，打开半衰期为18.8min，如在激光共聚焦扫描显微镜下所。相比之下，未经前处理的对照细胞的背景可忽略不计。这些信号具有很高的细胞内信噪比，最高可达131倍。它们特定地位于所需的细胞器上，与商业参考染料的共定位证实了这一点(皮尔逊相关系数=0.96)。相反，直接用生物正交加合物B11-2处理的细胞表现出较差的细胞器靶向性，皮尔逊相关系数为0.30。这可能是由于荧光加合物的不希望的聚集，这损害了细胞器的靶向性。这些结果表明，我们的AIEgen原位形成策略通过在不同的细胞细胞器之间提供高荧光信噪比来提供优势，而不考虑不同的亚细胞环境。
我们研究了我们的AIE探针是否与其他已建立的生物正交化试剂和用于细胞内多路成像应用的AIEgens兼容和相互正交。作为概念验证，我们选择了DBCO-Cy5荧光团16和三苯基膦叠氮衍生物15作为菌种促进的叠氮-炔环加成反应(SPAAC)的反应对，以及四嗪生物正交反应。用HaloTag配体14进行核靶向处理，用配体15进行线粒体靶向处理，然后同时添加探针2和16。在短暂的清洗后，我们进一步使用商业AIE染料AIE-MEM标记细胞膜。随后的共聚焦成像显示，在细胞核中有一个明显的红色信号，与核靶向Halo-EBFP2-H2A精确共定位。同时，我们在Cy5窗口可见生动的线粒体染色和绿色的细胞膜标记。尽管探测器2和Cy5在近红外区有发射重叠，但2的大斯托克斯位移使不同波长的激发成为可能，从而暂时将其信号与Cy5的信号分开。图像的像素强度分析显示，每个目标细胞器对应着明显的荧光信号，信噪比高达周围区域的168倍。为了探索这种潜力，我们使用转染了Halo-EBFP2-H2A的293T细胞进行了概念验证实验，其中蓝色荧光作为蛋白质表达和转染效率的读数。这些细胞用生物正交伴侣14预处理，然后用等浓度的探针2（AIEgen）和HF645孵育以进行直接比较。标记后，从不同领域随机捕获五个共聚焦图像，并量化单个细胞的蓝色和红色荧光强度。
HF645表现出荧光随蛋白质表达增加而线性增加（黑色迹线），与常规探针的行为一致。相比之下，探针2表现出S型荧光响应，由对应于临界表达阈值（紫色和蓝色迹线）的拐点标记。这表明足够的蛋白质表达触发了探针聚集和二次荧光开启。低于该阈值，探针2产生了最小的背景信号，如放大插图中的低强度细胞所示。.为了进一步验证这一行为，我们使用荧光激活细胞分类(FACS)进行了面对面的比较。探针2成功地将EBFP2阳性细胞区分为两个分离良好的群体：54.6%的细胞低表达，32.3%的细胞高表达。相反，HF645产生了广泛、连续的荧光分布，在细胞分选过程中无法分辨不同的表达状态。我们评估了AIE探针在监测与疾病进展相关的动态生物标记物变化方面的潜力。为此，我们建立了人脑微血管内皮细胞缺氧-再灌注损伤的细胞模型。整合素αvβ3被选为靶生物标记物，因为它在缺氧/再灌流诱导的应激过程中表达上调。将暴露于OGD/R的HBMEC与RGD-BCN和探针2共同孵育，而对照组维持在常氧条件下。流式细胞仪分析显示，当使用探针2时，OGD/R处理组和对照组之间存在显著的荧光强度差异，从而实现了精确的一步检测。相比之下，商品化的αvβ3抗体(FITC抗人CD51)在两种情况下未能显示出显著的信号差异。为了令人信服地证明我们的方法相对于经典免疫标记的有效性，我们使用Western印迹分析作为阳性对照实验来验证表达水平的变化。Western blotting与我们的方法得到了一致的结果，显示了相似的趋势和可比的折叠表达变化。这些结果表明，我们的生物正交AIE策略能够直接和灵敏地监测动态生物标记物的表达，在未来的翻译和实际应用中具有广阔的潜力。
结论
我们开发了一种新型的生物正交法原位形成的AIEgen支架。通过使用四嗪和TICS旋转来调制荧光强度的双锁定策略，这些荧光团的前体提供极低的背景发射。通过生物正交反应(破坏四嗪)和形成分子聚集体(抑制TICS旋转)，原位生物正交加合物提供高达1033倍的荧光强度。这些生物相容的AIEgen具有很大的斯托克斯位移(最高可达201 nm)，在远红区和近红外区域(最高可达665 nm)发射可调。由于其良好的生物正交性，这些AIEgen可以在各种细胞器中原位形成，并与其他生物正交工具和AIEgen兼容，用于细胞内靶标的多重标记。
参考文献
Bioorthogonal In Situ Formation of AIE Luminogens for Imaging Disease Progression via Sigmoidal Signal Amplification,Xinyu Yu , Xirui Liu , Hongbao Sun , Tianruo Shen , Yingqiao Deng , Haiyan Ren , Peixuan Zou,Angew.Chem.Int.Edition,vol.64,2025,https://doi.org/10.1002/anie.202511705.
