内容提要
活性硫物质（RSS），如硫化氢（H2S）、过氧化氢/多硫化物（H2Sn，n > 1）、氢过硫化物（RSSH）和多硫化物（RSnR，n > 2）被认为在氧化还原生物学中起调节作用，各种RSS在生理环境下的不稳定性和它们的高反应性给我们提出了独特的挑战。我们从探索H2S与其他RSS的特异性反应入手，在此基础上开发了几个系列的H2S探针，然后研究了H2Sn、硫烷硫、HSNO等其他RSS的反应，开发了相应的探针，这些探针的研究启发我们开发其他相关的化学工具。本文的重点包括：（1）每种探针模板的合理化学设计;（2）每个探针模板的评估和机理见解;以及（3）探针/化学工具的性质和应用。
基于亲核反应的H2S探针
基于2-吡啶基二硫化物的探针（WSP系列）
与双硫醇相比（例如，GSH、Cys等），H2S具有最低的pKa（6.9），并且是最小的尺寸。因此，在生理环境下，H2S（以HS的形式）是比双硫醇更强的亲核试剂。作为未取代的硫醇，H2S可以进行两次亲核反应，而双硫醇（单取代硫醇）只能进行一次亲核反应。我们的第一个H2S探针，设想H2S可以与一个亲电位点反应，形成含− SH的中间体。这将与另一个亲电位点发生分子内反应。我们选择酯基作为第二个亲电位点，因为许多含− OH的荧光团的荧光将在−OH基团上形成酯时淬灭。因此，与H2S的两步级联反应将形成−SH亲核试剂，然后裂解酯键，释放含− OH的荧光团并恢复强荧光。这种设计的优点是探针的所有三个组分（即亲电位点、接头和荧光团）可以容易地被修饰，因此这种设计具有提供对H2S具有优异活性的探针的潜力。这种设计导致了WSP系列的开发，作为2011年报道的第一个基于亲核反应的探针。WSP1由于荧光素上的−OH酰化而显示出低荧光，H2S应该与2-吡啶基二硫化物反应形成含−SSH的中间体我们使用了几种荧光团，包括7羟基香豆素，试卤灵和TokyoGreen，来构建探针，WSP 5具有最佳的性能（在缓冲液中的优异稳定性和47 nM的H2S检测限（LOD））。WSP的吡啶基二硫基也可与双硫醇反应（尽管不开启荧光），当H2S和生物硫醇共存时，这可能需要高的探针负载浓度。使用阳离子表面活性剂十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）作为共溶剂可以显着提高探针的反应性和灵敏度。
基于Michael加成环化的探针
在生理条件下，H2S和硫醇可以与一些Michael受体发生Michael加成反应， Holmes等人的报告表明，虽然硫醇容易与Michael受体发生Michael加成反应，。在生理pH下与某些Michael受体反应，不能得到产物。这表明与这些底物的反应是快速平衡过程，不产生稳定的加成产物。我们设想这种反应性可用于开发H2S探针。探针2-I应与H2S反应形成中间体2-II，然后与酯基进行分子内环化以释放荧光团。探针也可以与硫醇反应，但是添加应该是可逆的，并且不会消耗探针或打开荧光。它们显示出对H2S的良好选择性，并且硫醇的存在不影响H2S检测;观察到仅含有H2S的溶液和H2S/硫醇混合溶液的相当的荧光。
基于二硒化物的探针
发现基于二硒醚的模板（SeP）是有希望的。该模板应与H2S反应以形成硫代苯硒酚衍生物（3-I）和苯硒酚衍生物（3-II）。结果表明：3-I分子内快速环化释放荧光团，苯硒醇中间体不稳定，易被空气氧化而改革成探针，二硒醚模板可与生物硫醇反应生成中间体3-II和3-III，3-II在空气中改革成探针。然而，3-III应该对H2S具有高反应性以产生3-I，其将经历分子内环化以释放荧光团。根据这一思路制备了几种探针，SeP 1和SeP 2对H_2S的荧光反应迅速（约12 min），而SeP2对H2S的荧光反应不明显。高浓度的生物硫醇（Cys或GSH，1 mM）的存在不会导致探针对H2S（50 μM）的响应的荧光显著降低。SeP2能够感知由CBS抑制剂（氨基氧乙酸）或激活剂（S-腺苷甲硫氨酸）引起的内源性H2S浓度变化。二聚体二硒醚结构的探针使它们在水溶液中溶解度差，在这些研究中使用高浓度的有机溶剂（50%乙腈或DMSO）。
硒基硫化物探针
根据二硒醚类探针的反应机理，我们发现硒基硫醚3-III是一个稳定的中间体，它应该对H2S具有很高的反应活性，因此会发出荧光。当然，它也可能与硫醇反应，但这样的反应应该会产生另一个−Se− S−加合物，因为先前的研究已经证明RSH在− Se-S −键的Se原子上的亲核攻击在化学上是有利的并且在动力学上更快。因此，3-III和RSH之间的反应不应开启荧光，也不会消耗该中间体作为探针。III明显小于基于二硒的SeP探针，这可能增加溶解度。考虑到这一想法，我们研究了一系列SeSP探针（SeSP 1 −9），发现这些探针对H2S具有高度选择性，并且它们对H2S的反应在生物相关浓度下不受Cys或GSH的显著影响。与二硒化物探针相比，它们的溶解性有很大提高，在PBS缓冲液（含1%DMSO）中表现良好，如SeSP 1对H_2S的荧光响应在10 min内增强了1800倍。另一个观察结果是S-芳基探针比S-烷基探针具有更高的反应性。
硫烷硫的探针
用于硫烷的硫检测的传统方法是氰解，氰化物阴离子（CN-）与硫烷硫反应生成硫氰酸盐（SCN-），然后转化为红色的[Fe(SCN)6]3-用于光谱定量。该方法利用硫烷硫的亲电性，基于硫烷硫的亲电性，我们开发了一种基于反应的荧光探针，称为硫烷硫探针（SSP）。含有苯硫酚部分，酯连接基和含羟基的荧光团。亲核苯硫酚（−SH）将与亲电硫烷硫反应形成−SSH中间体，然后，它将迅速与酯部分进行分子内环化，释放荧光团。该过程对硫烷硫具有高度选择性。探针给出了强的使用RSSH、H2Sn和元素硫（S8）的荧光。其他物种，如生物硫醇，活性氧和氨基酸，不引起荧光反应。因此，SSP是硫烷硫特异性探针。在测试的SSP中，SSP 4具有最高的灵敏度和反应活性，对硫烷硫的荧光增强超过900倍。合成了一种特殊的SSP（SSP 5）。SSP 5的rhodol荧光团使其具有长激发波长（582 nm）、远红光发射（>600 nm）和优异的光稳定性，适合用作基于智能手机的床旁（POC）设备。与POC设备结合，SSP 5能够快速、低成本地检测合成尿液系统中的硫烷。
H2Sn探针
基于2-氟-5-硝基苯甲酸酯的探针
作为硫烷硫族的重要成员，H2Sn在水溶液中不稳定，通常以多种多硫阴离子的组合形式存在（n = 2，3，4等），其中H2Sn是最丰富的。在H2Sn探针的设计中，研究人员通常关注H2Sn。我们认为H2Sn是H2S类亲核试剂，因此，我们探索了含有两个亲电位点的探针，用于选择性地与H2Sn反应。2014年，开发了第一个H2Sn荧光探针（DSP 1 −3）。DSP探针利用2-氟-5-硝基苯甲酸酯作为荧光探针。识别基团检测H2 S2这涉及两步反应机制：与H2Sn的SNAr反应和随后的-SSH中间体的分子内环化以释放荧光团。硫醇（RSH）可以进行SNAr反应，但相应的加合物不应该进行第二步以导致荧光团的释放。另一方面，在DSP探针中，DSP-3的荧光性能最好，与H2Sn（10 μM DSP-3与50 μMH2Sn）反应后，其荧光增强了137倍，检测限为71 nM。
PSP系列
虽然2-氟-5-硝基苯甲酸酯基探针（DSP 1 − 3）对于检测H2Sn具有灵敏度和选择性，但它们的氟苯结构也使它们容易与生物硫醇（如Cys，GSH）反应。虽然这些与硫醇的反应不会导致荧光开启，但探针本身会被消耗。这需要更高的DSP探针负载浓度才能用于生物系统。为了解决这一局限性，我们研究了更具体的，选择性的反应与H2Sn和开发了一系列的2我们的PSP设计利用了H2Sn独特的双重反应性，其可以充当亲核试剂和亲电试剂基本上，H2Sn将能够与2-羟基苯甲酸酯进行硫酯交换反应。（酰硫基）苯甲酸酯模板（硫酯基的H2Sn亲核试剂的陷阱），导致苯硫酚中间体的形成。然后，该中间体能够与H2Sn反应（现在作为亲电体），形成过硫化物中间体，然后可以快速进行分子内环化并打开荧光团。利用该模板的一个考虑是硫酯和硫醇之间的反应是公知的（例如，天然的）。在生物系统中，例如在细胞中，生物硫醇的浓度相比之下相对较低，并且反应将在更温和、中性、和含水环境。这种组合预期会导致硫酯和生物硫醇之间的非生产性反应。为了进一步提高选择性，我们还操纵了模板中的R基团，以区分探针与硫醇和H2S2的反应速率。这种不同的空间和电子效应的应用使我们合成了PSP-1，PSP-2，我们的分析表明，PSP-2中庞大的叔丁基基团的空间效应降低了其对H2S2的反应性，导致与PSP-1和PSP-3相比，荧光强度降低和启动较慢。就选择性和稳定性而言，发现PSP-1对双硫醇不稳定，PSP-2和PSP-3稳定性较好，在此基础上，我们进一步分析了PSP-3对H2S2的反应性、选择性和灵敏度，并将其应用于COS-7和Vero细胞的H2S2荧光成像。
基于氮丙啶的探针
考虑到H2S2的强亲核性，我们探索了它与包括氮丙啶在内的几种亲电试剂的反应。我们发现磺酰基氮丙啶对H2S2具有选择性，因为它们不与H2S或硫醇反应。这导致了基于氮丙啶的探针AP的发展由于对丹磺酰基荧光团的扭曲分子内电荷转移（TICT）效应，AP显示出弱荧光。氮丙啶环打开，抑制TICT效应，并导致在530 nm处的强荧光发射。AP显示出0.3 μM的中等检测限。
HSNO/HSSNO荧光探针
我们设想HSNO（或HSSNO）是一个双功能分子。与硫烷硫一样，它可以作为亲电试剂进行硫转移，同时作为亚硝基硫醇，它也可以进行转亚硝化反应，基于这一双重反应性，我们设计了一种HNO特异性探针（TAP-1）通过安装两个HSN 0反应性位点来修饰基于荧光素的荧光团：2-巯基苯甲酸酯和苯二胺。由于−OH基团的保护和荧光团的分子内螺环化，探针是无荧光的。探针与HSNO/HSSNO反应时，2-巯基苯甲酸的硫转移反应和苯二胺的N-亚硝化反应形成游离的荧光素-苯并三唑衍生物9-I，其显示出强荧光。TAP-1对HSNO显示出高灵敏度和特异性。它被应用于观察内源性HSNO的形成，该内源性HSNO通过半胱氨酰-tRNA合成酶（汽车）产生的H2S与NO供体NOC 7，在HEK 293 T细胞中，TAP-1不能区分HSNO和HSSNO，因为这两种物质具有相同的双重反应性。
H2S-H2Sn双探针
由于H2S和H2Sn都是生物相关的，并且可能共存，我们探索了可以使用不同发射通道可视化H2S和H2Sn的探针。我们期望这样的双检测探针对于理解H2S和H2Sn之间的关系是有用的。我们使用刚性哌嗪连接基来桥接两个荧光团，因为它为香豆素-对苯二酚支架中的Foster共振能量转移（FRET）提供了优势，这防止了染料之间的π−π堆积。我们还使用了香豆素叠氮化物和苯基2-（苯甲酰基硫基）苯甲酸酯保护的对羟基苯甲酸酯作为相应的H2S和H2Sn反应位点。这些修饰使探针无荧光，而它们的H2S或H2Sn反应产物应显示强荧光。应该注意的是，在以前对H2S探针的研究中，研究人员很少验证探针对H2Sn的选择性。我们比较了香豆素-叠氮探针（AzMC）对H2S和H2Sn的响应，发现它显著降低了H2S和H2Sn的响应。这些结果表明香豆素叠氮化物对H2S的反应性显著高于H2Sn。DDP-1的荧光开启机制描述：如果探针用H2Sn、苯基2（苯甲酰硫基）苯甲酸酯应该是打开对苯二酚荧光的优选反应位点（通过形成10-I）。即使叠氮基被H2Sn部分还原以形成少量10-III，由于两个荧光团之间的FRET，它不应该影响荧光发射通道。总的来说，探针与H2Sn的反应应仅产生绿色荧光。1和H2S的反应比较复杂，我们证明了H2S不能使2-（苯甲酰基硫基）苯甲酸苯酯基荧光团发光，因此H2S应该优先与叠氮基反应生成10-II，释放香豆素的蓝色荧光。然而，H2S与叠氮化物的反应可导致H2Sn的形成，因此在该过程中还形成10-III，并由于FRET而产生对苯二酚的绿色荧光。然而，从1当量的H2S和叠氮化物的反应中应产生<0.5当量的H2Sn。2-（苯甲酰基硫基）苯甲酸苯酯的反应需要至少2当量的H2Sn。因此，在此过程中仅会产生少量的10-III。我们预期DDP-1与H2S反应会产生香豆素（主要）和对苯二酚（次要）的发射信号，发现探针DDP-1是无荧光的，用H2S处理探针在452和542 nm处产生两个不同的发射信号H2S2只在542 nm处产生一个发射波长（绿色荧光），其检测限为纳摩尔级，且该探针对H2Sn比对H2S更敏感。
占吨衍生的NIR荧光团
我们首先以对苯二酚为模板，在氧杂蒽基序上引入四氢喹喔啉环，得到荧光团（WR1，WR2）具有显著红移的发射最大值（>660 nm）沿着大的斯托克斯位移（>120 nm）。新的荧光团在水性缓冲液中的荧光量子产率相对较低。受发现用更刚性的环胺取代四甲基罗丹明中的N，N二甲胺可以提高量子产率的启发，然后，我们合成了几种新荧光团的类似物，同时引入了改性的吡咯烷环。荧光量子产率（0.20）、较宽的斯托克斯位移（111 nm）以及在水介质中优异的光稳定性。同时，pH依赖性荧光研究表明，WR 6含有氯取代基，与其他化合物相比，WR6的pKa值较低，为4.7，即使在温和的酸性条件下也能保持较强的荧光。不同蜂窝环境中的成像应用。为了验证WR 6的适用性，以我们建立的WSP和SeSP为模板，制备了两种用于检测H2S的近红外荧光探针。实验结果表明，两种探针在暴露于H2S时均表现出快速而显著的荧光增强。其中SeSP-NIR具有优越的上级选择性，检测限低至6 nM。此外，在HeLa细胞中的荧光成像证实SeSP-NIR可以检测内源性H2S，并且具有良好的细胞渗透性和最小的细胞毒性。
结论和展望
我们的团队开发了多种用于检测RSS的荧光探针如WSP 1，WSP 5和SSP 4。虽然已经报道了许多用于H2S检测的探针，但是用于其他RSS，特别是过硫化物（RSSH）和多硫化物（RSnR）的探针仍然有限。已知RSSH、H2S、二硫化物和多硫化物通常共存于生物环境中;它们可能形成平衡的平衡，这进一步使它们的检测复杂化。考虑到氧化还原生物学对这些硫物质的日益关注，对于该领域来说，具有用于过硫化物和多硫化物的合适的荧光探针是重要的。然而，创建对这些RSS具有选择性的探针需要探索过/多硫化物的独特的、不同的化学和反应，这仍然是一个具有挑战性的研究课题。
参考文献
Activity-Based Fluorescent Probes for Reactive Sulfur Species,Ming Xian,* Yuqing Wang, Conrad Du, and Meg Shieh，Acc. Chem. Res. 2025, 58, 2804，https://doi.org/10.1021/acs.accounts.5c00483
