内容提要
本文将金刚烷基-二氧杂环丁烷部分与合理设计的二羟基蒽结合报道二羟基蒽衍生的荧光团（DhX-CL），在水溶液条件下产生了具有35.4%量子产率的亮黄色荧光团DhX-CL 4。通过π-电子延伸和受体工程导致具有高亮度和生物相容性的NIR荧光团。DhX-CL 7具有持久的化学发光特性，其最大近红外发射波长为808 nm，量子产率为3.17%。这些荧光团与分析物响应部分的笼合提供了可激活的荧光探针，用于β-半乳糖苷酶和过氧亚硝酸盐的体内成像。
结果和讨论
二氧杂蒽衍生化学发光探针的设计与表征
受具有不同乙烯基单元和发射最大值的花青染料的启发，我们寻求通过插入额外的亚乙烯基单元来扩展亚乙烯基取代的苯酚-二氧杂环丁烷中供体和受体之间的π电子桥，以使发射红移。这种结构修饰预计会降低化学发光效率，因为激发态反式到顺式光异构化导致非发射衰减。将稠合多环安装到亚乙烯基单元上将施加构象限制和结构刚性，从而阻断光异构化过程并提高发射输出，类似于构象受限的花青染料。我们采用延伸-限制策略来构建新的二氧杂环丁烷荧光团核心骨架，这包括在苯酚的帕拉延伸亚乙烯桥，二氧杂环丁烷与另外的单元，并通过稠合双环限制亚乙烯基单元。我们用三异丙基甲硅烷基（TIPS）笼住DhX-CL 1，产生DhX-CL 1-TIPS，通过氟化物去除TIPS原位产生DhX-CL 1以启动化学激发过程，产生电子激发的中间体，其弛豫为羧酸盐产物DhX-CL 1-ex并发射化学发光。
我们评估了在磷酸盐缓冲盐水（PBS）中用过量的四丁基氟化铵（TBAF）处理从DhX-CL 1-TIPS原位产生的DhXCL 1的化学发光性质。虽然DhXCL 1-TIPS是不发光的，但其通过TBAF转化为DhX-CL 1产生强的化学发光，肉眼容易看到亮黄色发射我们测量了DhX-CL 1的化学发光动力学曲线，并将其与Schaap的酚二氧杂环丁烷（一种广泛使用的参比发光体）进行比较，在水溶液条件下具有良好的化学发光量子产率。DhX-CL 1表现出强烈的化学发光爆发，比Schaap的二氧杂环丁烷强得多，并持续近1小时，半衰期（T1/2）为18分钟。DhX-CL1的CL在水性缓冲液中测量为3.62%。这些结果表明DhX-CL 1代表在水性条件下具有强烈化学发光的基于二氧杂蒽的二氧杂环丁烷发光团。
优化二氧杂蒽核结构提高化学发光效率
在原型DhX-CL 1的基础上，我们旨在优化二羟基蒽的结构，以提高化学发光性能。我们注意到邻位取代的氯的吸电子效应，其降低pKa并促进含苯酚的荧光团和发光团的去质子化，因此，我们设计了氯取代的衍生物DhX-CL 2。类似地合成其TIPS保护的前体DhXCL 2-TIPS。由DhX-CL 2-TIPS原位产生的DhX-CL 2在水性条件下产生比DhX-CLl更强的化学发光，半衰期为12分钟JhX-CL 2的CL为12.2%，是由DHX-CL 2-TIPS原位产生的DhX-CL 2的CL的3.4倍。DhX-CL 2在560 nm处表现出最大发射波长，与DhXCL 1相当并且与化学激发的产物DhX-CL 2-ex的最大荧光波长一致。我们探索了不同的稠环结构，以DhX-CL 2为基础，设计了两个类似物DhXCL 3和DhX-CL 4，其特征在于稠合的5元环戊烯环和稠合的6元O-取代的二氢吡喃环，TIPS保护的前体DhX-CL 3-TIPS和DhX-CL 4-TIPS以类似的途径制备。化学发光动力学曲线显示DhXCL 3和DhX-CL 4表现出比DhX-CLl高得多的发射强度JhX-CL 3产生更多的光子，并且表现出比DhX-CLl和DhX-CL 2更短的化学发光半衰期（T1/2 = 8分钟）。比DhX-CL 1高9.8倍，比DhX-CL 2高2.9倍，比DhX-CL 3高2.6倍，比Schaap的苯酚-二氧杂环丁烷高11063倍。DhX-CL_4的化学发光继续。几个小时，半衰期更长（T1/2 = 30 min）比DhX-CL 1 -3 DhX-CL 3和DhX-CL 4分别表现出566和560 nm的最大发射波长，其类似于DhX-CL 1和DhX-CL 2的那些，并且与化学激发产物的荧光发射波长相关。
二氧杂蒽衍生物近红外化学发光的扩展
为了开发具有更长发射波长的荧光团，我们接下来试图通过引入两个额外的亚乙烯基单元来进一步扩展亚乙烯基取代的苯酚-二氧杂环丁烷中供体和受体之间的π共轭桥。考虑到DhX-CL 4良好的化学发光性质和合成的可行性，我们利用其带有两个稠合多环的二羟基蒽样核心结构。在水性缓冲液中检测DhX-CL 5的化学发光性质，令人惊讶的是，DhX-CL 5发射强烈的化学发光，其显著红移至NIR区域，在780 nm处具有最大值，接近其化学激发产物DhX-CL 5-ex的荧光最大值（λFLmax = 760 nm）。在Schaap的二氧杂环丁烷中也观察到这种波长差异，可以通过对化学发光和荧光的不同溶剂化变色效应来解释。DhXCL 5显示出1.19%的CL和19分钟的半衰期。
二氧杂蒽衍生二氧杂环丁烷的受体工程增强近红外化学发光效率
为了提高水溶性和化学发光效率，我们应用了一种受体工程策略，其中TCF受体被修饰为用亲水酯基或聚乙二醇（PEG）链取代一个氰基。这导致了两种衍生物，DhX-CL 6和DhX-CL 7JhX-CL 6的前体，即DhX-CL 6-TIPS，通过与含酯的TCF衍生物缩合来合成，而DhX-CL 7通过铜催化的点击化学将炔基TCF衍生物与PEG链缀合来制备。DhXCL 6和DhX-CL 7与DhX-CL 5的最大化学发光强度相似，虽然DhX-CL 5和DhX-CL 6的化学发光信号分别以19和10分钟的半衰期衰减，DhX-CL 7表现出半衰期为332分钟的持久信号。DhX-CL 6的最大发射波长为785 nm，类似于DhX-CL 5，但相对于其化学激发产物DhX-CL 6-ex的荧光发射最大值红移（λFLmax = 760 nm）可能是由于溶剂化显色效应。值得注意的是，将DhX-CL 7的最大化学发光波长进一步扩展到808 nm，超过其化学激发的DhX-CL 7-ex的荧光发射最大值（λFLmax = 766 nm）与DhX-CL 5 -6相比，在DhX-CL 7中观察到的PEG诱导的波长红移与PEG缀合或PEG包封的荧光探针报道的现象一致，可能是由于PEG链的影响。DhX-CL 7的化学发光效率与DPT相当，远高于DPD我们还通过测量穿过不同厚度的鸡胸组织的化学发光来评估这些发光团的组织渗透深度。DhX-CL 7表现出比DPT和DPD强得多的渗透，由于其长波长和高化学发光效率。DhX-CL 7在808 nm处具有长发射最大值，3.17%的优异量子产率，以及在水溶液中的持久化学发光。
DhX-CL 4作为β-半乳糖苷酶化学发光探针的研究
DhX-CL 1 -7在所有测试浓度下都表现出低细胞毒性。我们首先研究了我们的黄色荧光团DhX-CL 4的适用性，并选择了β-半乳糖苷酶（β-gal），一种催化糖苷键水解并将乳糖转化为半乳糖的溶酶体水解酶。β-gal的上调与原发性卵巢癌密切相关。我们设计了一种β-gal荧光探针DhX-CL 4-gal，通过将β-gal-识别部分β-半乳糖苷通过对羟基苄基自分解连接基并入DhX-CL 4的酚基中，预期β-Gal裂解DhX-CL 4gal的β-半乳糖苷部分以释放DhX-CL 4，合成DhX-CL 4-gal。研究了DhXCL 4-gal对β-gal的化学发光反应，结果表，当β-gal不存在时，DhXCL 4-gal不产生化学发光，而加入β-gal后，DhXCL 4-gal产生强烈的化学发光，最大化学发光波长为560 nm计算出化学发光增强为2100倍。gal向βgal的转化，线性响应DhXCL 4-gal对β-gal的检测限（LOD）估计为9.5 µU mL−1，低于大多数报道的光学β-gal探针的检测限（73至4000 µU mL−1）。高效液相色谱（HPLC）分析检测到化学激发的DhX-CL 4-ex是DhX-CL 4-gal和β-gal之间反应的主要产物，证实了DhX-CL 4-gal检测β-gal的机制。选择性测定显示DhX-CL 4-gal仅在β-gal存在下表现出显著的化学发光增加，但对其它酶的响应可忽略不计。D-半乳糖（β-gal抑制剂）完全抑制化学发光增强。我们评估了DhX-CL 4-gal在活细胞中的β-gal的化学发光成像。细胞毒性试验显示，DhX-CL 4-gal在测试浓度下具有低毒性，我们在转染以表达β-gal的DhX-CL 4-gal负载的HEK 293 T细胞中观察到强烈的化学发光，但在缺乏β-gal的野生型HEK 293 T细胞中没有观察到强烈的化学发光。在表达高水平内源性β-gal的卵巢OVCAR 3癌细胞中，DhX-CL 4-gal产生强的化学发光信号，其被D-半乳糖消除。在卵巢SKOV 3细胞中检测到β-gal，其表达的β-gal水平低于OVCAR 3细胞。我们进一步应用DhX-CL 4-gal对活小鼠中的β-gal进行成像，为此，我们通过将SKOV-3细胞皮下植入活小鼠中来产生荷瘤鼠模型。DhX-CL 4-gal的瘤内注射在肿瘤中产生强的和时间依赖性的化学发光，这在接受载体的肿瘤中不存在，并且通过预注射D-半乳糖而基本上减弱。肿瘤内注射DhX-CL 4-gal后，SKOV 3和OVCAR 3荷瘤小鼠的比较体内成像证实了两种肿瘤类型中的强β-gal依赖性化学发光，OVCAR 3肿瘤表现出比SKOV 3肿瘤更强的信号，与细胞成像数据一致在健康小鼠中，DhXCL 4-gal显示最小的背景化学发光，而DhX-CL 4-gal与βgal的预活化混合物产生显著的和局部的信号，确认酶依赖性探针激活此外，我们在SKOV 3荷瘤小鼠中静脉内注射DhX-CL 4-gal后进行体内化学发光成像。在静脉内施用DhX-CL 4-gal后，在肿瘤中检测到强的和时间依赖性的化学发光信号，其被腹膜内预注射D半乳糖显著降低。
结论
我们的延伸-限制策略为构建此类荧光团提供了一种新的模块化二氧杂蒽核心骨架，通过分子生物学方法，。通过对该骨架的改造，我们得到了一个具有增强化学发光效率的黄色荧光团。通过对该骨架的改造，我们得到了一个具有增强化学发光效率的黄色荧光团。通过将识别部分并入酚基团中，我们将这些荧光团开发成可活化的荧光探针，用于生物分析物如βgal和ONOO-的检测和体内成像。
参考文献
Dihydroxanthene-Derived Dioxetane Chemiluminophores for Activatable in Vivo Imaging，Kongke Liao, Lina Zhang, Jie Jiang, Feifei Wang, and Tao Peng*，Angew. Chem. Int. Ed. 2025, e202514236，doi.org/10.1002/anie.202514236.
